大鼠脾脏组织经过研磨等处理后,得到大量的脾细胞混悬液,可以满足进一步的分离培养的需要;2.观察贴壁细胞, 1-3h细胞少量贴壁,12h左右的贴壁细胞增多, 24h的贴壁细胞减少。12h是贴壁细胞合适时间; 3.相差显微镜下观察到贴壁培养的脾脏巨噬细胞多为圆形或椭圆形,少数呈梭形或多边形。镜下观察细胞体积较大,细胞膜完整,细胞核清晰可见,胞浆内容物丰富;免疫组织化学结果显示贴壁的脾脏巨噬细胞CD68表达阳性,提示所得的细胞是脾脏巨噬细胞,台盼蓝染色显示细胞活力>95%,瑞氏染色鉴定细胞纯度>90%。
Romidepsin 结论:1分离培养出活力和纯度符合实验要求的大鼠脾脏巨噬细胞;2.贴壁12h是大鼠原代脾脏巨噬细胞的合适贴壁培养时间。 第二部分轻度热应激对大鼠脾脏巨噬细胞免疫功能的影响 目的:探讨轻度热应激对大鼠脾脏巨噬细胞免疫功能的影响。 方法:以始终处于37℃的大鼠原代脾脏巨噬细胞作为对照组,实验组将大鼠原代脾脏巨噬细胞置于41℃恒温箱中,使细胞轻度热应激1h,然后恢复到37℃,分成应激后0min,30min,60min,120min,180min五个亚组组,总共六个组;以吞噬中性红能力(OD540nm值)检测巨噬细胞的吞噬功能、噻唑蓝法测定巨噬细胞对L1210细胞的杀伤作用来反应巨噬细胞的杀伤活性,Transwell小室趋化装置观察巨噬细胞趋化活性变化;采用双抗夹心ABC-ELISA法检测大鼠脾脏巨噬细胞分泌的TNF-a,IL-12浓度的变化。 结果:轻度热应激(41℃、1h)后,实验组大鼠脾脏巨噬细胞的功能均发生了变化,而且与应激后恢复时间有关。热应激后0min,巨噬细胞的OD540nm值由正常的0.21±0.01上升到0.34±0.01(p<0.05),然后继续上升,至60min达最高值0.81±0.04(p<0.01),随后逐渐下降,应激后180min仍然有0.47±0.03(与对照组比较,p<0.05);杀伤活性由正常的35.30±4.37﹪上升到应激后0min的45.00±4.74﹪(p<0.05),在60min分钟达到最大值82.07±5.17﹪(p0.05);趋化作用也呈现大致相同的变化趋势,大鼠脾脏巨噬细胞正常趋化活性为23.40±5.32/HP;热应激1h后0min为34.60±5.22/HP(p< 0.01)。 结论:轻度热应激后,大鼠脾脏巨噬细胞的吞噬功能、杀伤活性、趋化活性都有上调;在实验时间内,大鼠脾脏巨噬细胞分泌的细胞因子TNF-α和IL-12在轻度热应激后随着时间的延长而增加。提示轻度热应激对大鼠脾脏巨噬细胞的免疫功能有促进作用。 第三部分Bip蛋白在轻度热应激大鼠脾脏巨噬细胞中的表达与意义 目的:探讨轻度热应激大鼠脾脏巨噬细胞Bip蛋白的表达及其对细胞功能改变的影响。 方法:原代培养大鼠脾脏巨噬细胞,将细胞置于41℃恒温箱中,使细胞轻度热应激,1h后恢复到37℃,分别检测应激后0min,30min,60min,120min,180min巨噬细胞BipmRNA、Bip蛋白的表达;同时段分别检测巨噬细胞吞噬功能、杀伤活性和趋化作用。
点击此处 结果:(1)轻度热应激后,大鼠脾脏巨噬细胞BipmRNA的表达明显增加,30min后到达高峰,60min、120min时仍高于对照组(p<0.01),180min后恢复至正常水平。Bip蛋白的表达在轻度热应激60min后到达高峰,120min、180min时仍高于对照组(p<0.01)。P38MAPK抑制剂预处理大鼠脾脏巨噬细胞,与应激组比较,热应激后巨噬细胞吞噬、趋化和杀伤活性明显降低(P0.05)。应激组P38MAPK蛋白表达明显上调,与对照组和抑制组比较差异有显著性(P<0.01);P38MAPK抑制剂预处理后,抑制组P38MAPK蛋白表达受到抑制,与应激组比较(P
目的:研究在缺血性脑水肿病理过程中,水通道蛋白家族(aquaporins, AQPs)表达变化的时空规律及其与脑水肿形成的关系,初步探讨AQPs在缺血性脑水肿过程中的作用及其表达调控机制。 方法:成年健康雄性Wistar大鼠392只,随机分为假手术对照组和缺血组,用大脑中动脉栓塞法制作脑缺血动物模型,假手术对照组除不插线栓外,其余操作与缺血组相同。每组在造模成功后1 h、3 h、6 h、12 h、24 h取出大鼠脑组织,分别采用HE染色、透射电镜对相应部位进行病理观察,干湿重法计算脑组织含水量变化,免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)、免疫荧光(Immunofluorence)观察各组相应时间点脑组织AQPs的表达变化,免疫印迹、Real-time
PCR、测定各组相应时间点水肿脑组织AQPs含量的变化。同时运用免疫印迹检测水肿脑组织ERK(Extracellular signal regulated LY294002核磁共振 kinase,ERK)含量的变化。 结果:在假手术对照组,脑组织形态、脑含水量、AQPs及其mRNA的分布及表达、ERK1/2总量以及磷酸化ERK1/2( phosphorylated ERK1/2, pERK1/2)量在各时间点均无明显变化。脑缺血后,光镜和电镜观察可见脑组织出现缺血性改变:细胞及血管周围间隙明显扩大,部分细胞坏死,胞核浓染或崩解,胶质细胞增生。缺血1小时后,脑含水量明显升高,并随缺血时间的延长而逐渐增加,在缺血后24小时达到峰值。免疫组化和免疫荧光结果显示,AQPs在海马、脉络丛、脑膜、视上核、室旁核、丘脑,大脑皮质等部位的星形胶质细胞上呈阳性表达;AQP3,AQP5,AQP8和AQP9还分布于丘脑和皮层下神经元。脑水肿组织中AQP4、AQP9及其mRNA的含量随脑缺血时间的延长而增加,在缺血后24小时表达最强。而AQP3, AQP5, AQP8及其mRNA在缺血后迅速增加,至6h到高峰,后缓慢降低,至24h仍高于对照组。脑水肿的形成过程中,AQPs mRNA和蛋白的表达呈高度正相关(P<0.05),AQP4、AQP9的表达与脑含水量的变化亦呈显著正相关(P0.05)。高渗液作用可导致细胞皱缩,细胞活性下降,折光性差,并随培养液高渗程度的上调和高渗液作用时间的延长而加重。在高渗液作用下,星形胶质细胞的AQP4、AQP9及其mRNA表达随高渗程度的增加而增强,AQP4、AQP9及其mRNA表达水平在12小时内持续增加,随后开始下降,至24小时后仍高于对照组(P<0.05);AQP3,AQP5和AQP8及其mRNA表达随高渗程度的增加而增强,于6h达高峰,随后开始下降,至24小时后仍高于对照组(P0.