05,n=3)。LPS在正常氧浓度状态下以剂量依赖方式刺激腹腔巨噬细胞产生TNF-α,在低氧状态下不同剂量LPS的刺激效果没有明显区别(p＞0.05,n=3)。小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α受低氧和SB203580影响的的模式与RAW264.7相似,低氧可使SB203580的抑制能力大约降低50%。 8.小鼠在正常氧浓度环境下接受不同剂量LPS 90 min后,血清TNF-α水平与正常对照组小鼠比较均有明显升高(p＜0.05,n=3)。 在正常氧浓度和低氧环境下(10%O_2),15 mg/kg和25 mg/kg剂量的SB203580均不能降低0.5 mg/kg LPS诱导的内毒素血症小鼠血清TNF-α水平(p＞0.05,n=3)。 小鼠在注射LPS 0.5mg/kg后240 min与90 min急性期比较,血清TNF-α水平有所下降(p＜0.05,n=3),24 h基本降至正常水平。 9.小鼠接受LPS注射90 min肺组织中已经可检测到HIF-1αmRNA。Real-timePCR比较发现HIF-1αmRNA的表达水平在SB203580治疗组和对照组之间没有明显差别(p=0.34)。同时Western
blot和免疫组化染色均可检测到HIF-1α蛋白的表达。免疫组化染色显示LPS注射90 min后HIF-1α蛋白主要位于在肺间质组织中。LPS注射240 min后,免疫染色阳性的细胞数目减少。与Western blot检测结果一致,SB203580并没有影响HIF-1α蛋白的表达量。 研究结论 1.低氧可以增强p38 MAPK的活性。p38 MAPK的特异性抑制剂SB203580在正常氧浓度下可以完全抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7中TNF-α表达,但在低氧(0.5%O_2或氯化钴模拟低氧)状态下却失去了这种抑制能力。 以及 2.低氧影响小鼠腹腔巨噬细胞对LPS反应和SB203580的抑制效果的模式与RAW264.7细胞相似。 3.低氧可以增强TNF-α的转录活动及mRNA的稳定性。SB203580在正常氧浓度下可以抑制TNF-α的转录,但并不能影响mRNA的稳定性。 4.低氧并不影响p38 MAPK和p-p38 MAPK的表达量,而是通过增强p38的活性,增加下游底物p-MK2的表达,从而增加TNF-α的合成。 5.HIF-1α在内毒素血症模型小鼠肺组织中表达,并且其表达水平不受SB203580的影响。SB203580不能有效降低伴随低氧状态的内毒素血症小鼠血清TNF-α水平。 6.低氧可能通过HIF-1α介导TNF-α的生物合成,并且调节通路不受p38抑制剂的影响,可能与p38通路起到协同作用。 创新及意义 1.本研究阐述了低氧在脓毒症TNF-α生物合成中起重要作用,低氧可提高p38 MAPK的活性,解释了p38抑制剂SB203580在脓毒症及脓毒性休克中具有争议性的体内应用效果。 2.本研究提示HIF-1α可能参与调节TNF-α的生物合成,低氧通过HIF-1α的信号传导可能独立于p38信号通路,并且两条通路有协同作用。我们的发现为理解低氧在脓毒症和脓毒症休克病理过程中的作用提供了新视角。
3.本研究提示在脓毒症和脓毒症休克的临床治疗中,除了TNF-α的生物合成机制,低氧的伴随病理状态也是必须考虑因素之一,为脓毒症的治疗提供了新的靶点和理论依据。
胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)来源于胚胎发育囊胚阶段的内细胞团,可以分化成机体三个胚层来源的所有组织细胞。自从1981年由Evans和Kaufman等建立了首个鼠ES细胞系及1998年Thomson等分离得到人ES细胞以来,ES细胞研究得到了长足发展,目前仍是生命科学研究热点之一。ES细胞的多向分化潜能使其在临床再生医学领域有巨大应用前景,然而发挥ES细胞在临床治疗方面巨大作用的前提是如何在体外扩增ES细胞,并保持其全能性。人ES细胞在体外培养时容易自发分化,因此需要将其培养在胚胎成纤维细胞上或利用添加细胞因子的条件培养基维持不分化,然而这些方法都较繁琐,不适合大规模培养,并且可能造成外源性蛋白污染。要找到一种更适合更简便的人ES细胞培养条件,首先必须要了解维持人ES细胞自我更新和多潜能性的分子机制。先前文献研究报道显示:多种因素参与调控人ES细胞自我更新,其中包括转录因子(Oct4、Nanog、Sox2等),信号通路(TGFβ信号通路、WNT信号通路、FGF和PI3K信号通路等),细胞周期调控因子,microRNA,染色体稳定性及DNA甲基化等。Oct4、Nanog、Sox2是目前研究较多的参与调控人ES细胞自我更新的转录因子,它们在人ES细胞中高表达,通过抑制人ES细胞向某一胚层分化来维持人ES细胞多潜能性,并且它们之间可相互作用形成复杂的转录调控环路,共同维持人ES细胞的多潜能性。近来研究报道除上述几个关键基因外,人ES细胞中还存在其它已知或未知基因参与其自我更新的调控过程,然而日前它们在人ES细胞中的功能及调控机制远未阐明。为了探索和揭示除Oct4、Nanog、Sox2外其它维持人ES细胞多潜能性的基因及其功能,更深入地阐明人ES细胞自我更新的复杂机制,本课题开展了人ES细胞自我更新相关基因的高通量筛选,并且进行了人ES细胞自我更新相关新基因的克隆和功能及转录调控研究。
一般 【人胚胎干细胞和拟胚体基因表达谱的初步分析】 基因芯片为高通量基因表达研究提供了一个有利工具。本研究中采用Affymetrix 此网站 Human Genome U133 Plus 2.0 Array芯片分析比较了未分化人ES细胞(H9)和分化7天的拟胚体(7-day embryoid bodies,7-day EBs)基因表达谱,检测到在人ES细胞分化形成的7-day EBs中约1100个基因表达下调大于2倍及2200个基因表达上调2倍以上,并通过real-time PCR证实了芯片结果的可靠性。在表达下调2倍及以上的基因中,包含了许多已经证实在维持人ES细胞自我更新中发挥重要作用的基因。例如:Oct4表达下调约14倍,Nanog表达下调约17倍,Sox2表达下调约2.6倍。目前已初步揭示在维持人ES细胞多潜能性过程中发挥一定作用的基因也被检测出在7-day EBs中表达显著下调。例如:TDGF1表达下调约11倍;LEFTB表达下调约42倍,DNMT3B下调约8倍等。此外,基因芯片检测结果中包含了大量未知基因(假定蛋白和EST序列),这些未知基因在人ES细胞分化时表达显著改变,但它们的完整基因序列目前仍未获得。其中两个EST序列(GenBank登录号:BF223023、BC020935)在人ES细胞中表达水平较高,尤其是BF223023在未分化人ES细胞中表达水平与Oct4和Nanog相似,而当人ES细胞分化形成EBs时其表达显著下调(19.