Iso和Ami分别作用于CIA大鼠FLS,检测FLS中Ras, Raf, p-MEK1/2和p-ERK1/2表达变化, rIL-1α和U0126分别作用于CIA大鼠FLS,检测FLS中Gi表达、cAMP水平和蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)活性,探讨两信号转导的交叉对话及关键作用交叉位点。

2.根据FLS中Ras, Raf, p-MEK1/2, p-ERK1/2, Gi, cAMP水平和PKA活性的变化,观察CIA大鼠FLS在Ami, rIL-1或U0126分别作用下,Pae对Ras-MAPKs和G蛋白- AC–cAMP两信号转导交叉对话的影响及通过哪些环节发挥调节作用。 方法 用鸡Ⅱ型胶原(typeⅡcollagen, CⅡ)免疫Sprague-Dawley(SD)大鼠诱导CIA。在炎症出现后,灌胃给予CIA大鼠Pae(25, 50, 100 mg·kg-1),每天一次。大鼠体重每隔4天称重一次。用MK-550容积仪每隔4天测量大鼠右后足爪容积。采用0-4分尺度每隔4天评定关节炎指数(arthritis index, AI)。进行大鼠膝关节组织病理分析。分离和培养FLS。FLS被不同的激动剂、抑制剂或药物作用如Iso, JNJ-26481585临床试验 Ami, rIL-1, U0126或Pae。采用3H-TdR掺入法检测IL-1的活性。TNF-α和PGE2的产生分别采用125I放免试剂盒测定。运用免疫组化和Western blotting技术检测滑膜细胞中Gi, Ras, Raf, p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达。用竞争蛋白结合分析法(competitive protein

binding assay, CPBA)检测滑膜细胞中cAMP水平,用激酶发光分析法测定滑膜细胞中PKA的活性。 结果 Ⅰ.CIA大鼠FLS中Ras-MAPKs与G蛋白- AC–cAMP信号转导的交叉对话及关键作用交叉位点 1.大鼠CIA建立与评价。在CIA大鼠中可见明显的炎症反应,体重增长缓慢,足爪肿胀,关节炎指数升高,伴有关节滑膜组织增生、血管翳形成和软骨侵蚀。IL-1活性增强,TNF-α和PGE2的产生增加。 http://www.selleckchem.cn/products/streptozotocin.html 2. CIA大鼠FLS中Gi, Ras, Raf, p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达。CIA大鼠FLS中Gi, Ras, Raf, p-MEK1/2和p-ERK1/2表达增加。Gi, Ras, Raf和p-ERK1/2的表达在d20至d28较高,在d20前后p-MEK1/2的表达较高。 3. Ras-MAPKs信号转导对G蛋白-AC-cAMP信号转导的影响。rIL-1α可促进Ras, Raf, p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达,提高Gi蛋白表达、cAMP水平和PKA活性。U0126可抑制rIL-1α诱导的p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达,降低rIL-1α诱导的Gi蛋白表达、cAMP水平和PKA活性。rIL-1α作用15min后,Ras和Raf表达水平开始升高,作用30 min后,Gi表达水平开始升高。U0126作用30 min后,p-MEK1/2表达下降,作用60 min后,cAMP水平和PKA活性开始下降。 这些结果提示Ras-MAPKs路径的活化可以促进G蛋白偶联信号转导;抑制MAPKs级联应答能抑制G蛋白偶联信号转导。 4. G蛋白-AC-cAMP信号转导对Ras-MAPKs信号转导的影响及作用交叉位点。Iso可促进Gi蛋白表达,升高cAMP水平和PKA活性,但对Ras,

Raf, p-MEK1/2和p-ERK1/2无明显影响。Ami能抑制Ras, Raf, p-MEK1/2和p-ERK1/2表达,升高cAMP水平和PKA活性,对Gi蛋白表达无影响。Ami作用15 min时,开始提高cAMP水平和PKA活性;作用30 min时,Ras表达开始下降。这些结果提示升高cAMP水平和PKA活性能够抑制Ras–MAPKs级联应答;其作用交叉位点可能是通过PKA下调膜蛋白Ras表达,而进一步抑制Ras-MAPKs信号转导。 Necrostatin-1购买 Ⅱ. Pae对CIA大鼠FLS中G蛋白- AC–cAMP信号转导和Ras-MAPKs信号转导两信号转导路径联系的调节及作用环节 1. Pae抑制CIA大鼠炎症反应及FLS中炎症介质的产生。Pae恢复CIA大鼠降低的体重,抑制足爪肿胀,减低AI,改善组织病理。Pae也明显抑制FLS中IL-1的活性及TNF-α和PGE2的产生。 2. Pae对CIA大鼠FLS中G蛋白- AC–cAMP信号转导的调节作用。CIA大鼠FLS中Gi蛋白表达增加,cAMP水平和PKA活性下降。Pae体内和体外可以抑制Gi蛋白的表达,恢复低下的cAMP水平和PKA活性。 3. Pae对CIA大鼠FLS中Ras-MAPKs信号转导的调节作用。CIA大鼠FLS中Ras, Raf, p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达增加。体内和体外给予Pae后,Ras, Raf, p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达明显下降。 4.