HRP催化H2O2氧化2-氨基-3-羟基吡啶的酶促反应产物,在缓冲液中-0.36V处产生一个灵敏的伏安还原峰,借助此峰可以测定游离的HRP,进而可用于以HRP为标记物的酶联免疫分析。对酶促反应条件和测定条件的优化反应条件为:以B-R缓冲液(pH6.0)为反应介质,在10mL总反应液中含有1.0mL0.2mol/LB-SelleckR缓冲液、3.0mL8.0mmol/L2-氨基-3-羟基吡啶溶液以及1.5mL0.5mmol/LH2O2溶液,反应温度37℃,反应时间30min。最佳测定条件为:B-R缓冲液(pH7.0)为支持电解质,在10mL总测定溶液中含有5mL上述总反应液、1.0mL0.2mol/LB-R缓冲液。测定VX-765仪器条件:起始电位0.00V,终止电位-0.80V,电位扫描速度400mV/s,滴汞静止时间7s。在最佳的反应条件和测定条件下,新体系测定游离HRP的线性范围为4.0×10-4～1.0μg/L;对HRP的检出限为0.12ng/L。新体系对CEA测定的线性范围为0.50～80.0μg/L;检出查找更多限为0.50μg/L。为经典ELISA法的检出限的1/10。”
“以RT-PCR方法扩增目的基因P58IPK,将其克隆至原核表达质粒pGEX-6p-1。将所构建的pGEX-6p-1-P58IPK重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)并诱导表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE、Western-blot及体外活性鉴定。