05)。与MOD组比较,INH组收缩压下降(P<0.05)。MOD组炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α表达量显著高于CON组(P0.05)；与CON组比较,MOD组P38 MAPK/NF-κB通路蛋白p-P38 MAPK、p-IκB显著增加。INH组p-P38 MAPK、p-IκB与CON组比较差异均不显著(P>0.05)。结论：体内环境下,CIH可能通过P38 MAPK/NF-κB信号通路引发血管内皮的炎症损伤,造成模型小鼠血压升高。P38

Compound C分子量 MAPK抑制剂SB203580可通过抑制P38 MAPK/ NF-κB信号通路抑制CIH后的炎症状态并抑制小鼠血压升高。实验研究二补肾清肝方对间歇性低氧模型血管内皮P38 MAPK/NF-κB信号通路的干预效应研究第一部分补肾清肝方有效组分对人脐静脉内皮细胞间歇性低氧模型P38 MAPK/NF-κB信号通路的干预效应研究目的：体外环境评价中药复方补肾清肝方对IH后血管内皮炎症损伤的保护效应并探讨其作用机制。方法：在HUVECs的IH模型基础上,按1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml加入补肾清肝方有效组分(异钩藤碱、桃叶珊瑚苷、川芎嗪,GDC),进行最佳浓度筛选。最佳用药浓度确定后,实验分为4组：正常对照组(CON组)、间歇性低氧组(IH组)、IH+补肾清肝方有效组分组(GDC组)以及IH+P38 MAPK抑制剂组(INH组)。中药预处理30min后开始造模,造模方法同前。进行细胞粘附功能检测、QPCR检测ICAM-1、E-selectin、IL-1、IL-6、TNF-α含量,细胞免疫荧光及Western-blot法检测P38 MAPK/NF-κB通路蛋白的表达。结果：QPCR结果提示GDC 0.01μg/ml干预后炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α表达量均低于IH组(P0.05)。细胞粘附实验结果显示,GDC组HUVECs的粘附细胞数明显低于IH组(P<0.05),AB组降压效果优于BSQG-H组(P<0.05)。QPCR结果显示BSQG-H组IL-1、IL-6、TNF-α表达量低于MOD组(P0.05)。同时BSQG-H组抑制IL-1、IL-6优于阳性药对照(AB组)(P
肾小球硬化是肾小球肾炎和其他肾脏疾病发展过程中的一种常见病理改变,其主要病理特征是肾小球内细胞外基质(Exrtaclleluar

17-AAG分子量 Mtarix,EcM)过度沉积。而肾脏系膜细胞(mesnaigal clle,MC)是目前公认的分泌肾小球ECM的主要细胞,在维持肾小球结构和功能完整性方面都发挥重要作用。Ⅳ型胶原(tyepⅣcollagen,collagneⅣ)是肾小球ECM的重要成分之一,特别是发生肾小球肾炎和肾小球硬化时,在MC能够影响到的系膜区和基底膜部位,Ⅳ型胶原的含量明显增多。因此,研究肾小球MC中W型胶原的表达及其影响机制,对于认识和调控肾小球硬化具有重要意义。MC可自分泌多种细胞因子,转化生长因子β1(Transfomring growth factorβ1,TGF-β1)就是其中的一种,TGF-β1是TGF-β超家族的成员,上调ECM基因表达、促进ECM沉积是其重要功能之一。因此,TGF-β1在肾小球硬化过程中发挥重要作用。TGF-β1主要靠其下游的信号传导通路来发挥作用,Smads家族是TGF-β1下游经典的信号传导分子。除此之外,还存在其他一些非Smad通路,如MAPK通路、AKT/IP3K通路等。MAPK信号通路是目前己证实的TGF-β1下游重要的非Smda信号通路之一,而且大量报道显示,TGF-β1/Smda和MAPK通路之间存在串话,其中以E双1/2与Smad之间的关系研究最多,JNK、p38与Smad通路之间的关系研究相对较少。饰胶蛋白聚糖(Decroin,DCN)是一种富含亮氨酸的小分子量蛋白聚糖,也是MC分泌的重要成分之一,主要分布在结缔组织中,属于ECM成分的一种。在调节细胞增殖分化、ECM合成沉积、细胞因子功能等方面发挥重要作用。DCN可以通过多种机制拮抗TGF-β1的生物学功能,因此,DCN是TGF-β1重要的抑制因子。我们实验室前期工作已证实,DCN可以抑制大鼠肾脏MC生长和基质合成,动物实验中,DCN可拮抗大鼠抗Thy-1.1肾炎模型病变肾小球的程度和发展。但其在肾小球病变中的作用机制目前还没有完全阐明。在肾小球硬化中,TGF-β1主要作用于肾脏MC。研究表明,肾小球病变时TGF-β1田在激活Smad信号通路过程中,也有MAPK通路信号分子被激活。但MC中MAPK-Smad信号分子之间的串话作用研究还是较少的。Hayshiad等曾证明人的MC中,ERK1/2依赖的Smda3连接区磷酸化能够促进Ⅰ型胶原的表达,但ERK1/2和Smda通路之间相互影响的复杂机制还是没有完全了解。因此,本实验中我们在体外培养的大鼠MC中继续深入研究MAPK和Smda通路之间的串话作用,特别是除ERK1/2分子外,JNK及P38与Smad2之间的串话,以及这些串话在MCTGF-β1即诱导的Ⅳ型胶原表达过程中的作用。同时,初步探讨DCN对Ⅳ型胶原表达的影响,及其对TGF-β1活化的MAPK和Smda通路的作用,为后续研究的展开做好铺垫。

所以 第一部分TGF-β1诱导的大鼠系膜细胞Ⅳ型胶原表达过程中MAPK对Smad2通路的影响 目的探讨外源性TGF-β1对体外培养大鼠MC表达Ⅳ型胶原以及对MAPKs和Smad2信号通路的影响,同时观察该过程中MAPK对Smad2信号通路的影响。 方法培养大鼠MC,在培养液中添加外源性TGF-β1,采用Western Blot方法观察MC内Ⅳ型胶原和MAPKs表达的变化；或者通过预先在培养液中分别添加MAPK信号通路抑制剂U0126、SB203580、SP600125,再用外源性TGF-β1因子刺激,采用Western Blot方法观察MC内Ⅳ型胶原以及MAPKs和Smad2表达的变化,同时采用Real time RT-PCR检测不同处理后,Ⅳ型胶原mRNA水平的改变。 结果用不同浓度的TGF-β1刺激MC 6h,可见Ⅳ型胶原从1 ng/ml开始有上升趋势,其中以2.5ng/ml升高最明显(P<0.05),表明外源性TGF-β1诱导的MC内Ⅳ型胶原表达升高呈剂量和时间依赖性。与此同时,TGF-β1激活了MAPKs和Smad信号通路,TGF-β1作用15min后可见磷酸化的ERK、JNK、p38和Smad2均表达升高,其中磷酸化的ERK、p38和Smad2在TGF-β1作用后1h达高峰,磷酸化的JNK在2h达高峰(P<0.05),但使用JNK通路抑制剂后,仅P-Smad2C下调(P0.

HUVECs的分离、培养及鉴定根据前期经验获取、分离、培养HUVECs,细胞经v WF抗体免疫荧光染色进行鉴定。取第3-5代细胞用于后续实验。2.体外制备、鉴定AGEs1.6 g牛血清白蛋白(BSA)与3.0 g D-葡萄糖溶于10 m L PBS中,避光孵育12周制备AGEs。荧光分光光度计鉴定AGEs。以同样条件下不含糖的BSA溶液孵育12周后制备的溶液作为本实验的阴性对照组。3.Western

blotting法检测p38 MAPK、e NOS磷酸化作用阴性对照组、AGEs组、GLP-1组、AGEs+GLP-1组分别检测p38 MAPK磷酸化蛋白及总p38 MAPK蛋白表达;阴性对照组、AGEs组、AGEs+GLP-1组、AGEs+p38 MAPK抑制剂组、AGEs+GLP-1+p38 和 MAPK抑制剂组分别检测e NOS磷酸化蛋白及总e NOS蛋白表达。p38 MAPK抑制剂预处理细胞1 h后,加入(或不加)GLP-1 100 n M干预30 min,最后加400 ug/m L AGEs作用24 h(本课题前期研究显示,400 ug/m L AGEs作用24 h后,可显著诱导内皮细胞凋亡;GLP-1采用100 nm浓度下,可显著抑制AGEs诱导的细胞凋亡)。阴性对照组采用与AGEs相同浓度的BSA溶液。(以下部分均按该方法操作,不再赘述。)4.流式细胞仪检测GLP-1及p38 MAPK抑制剂对细胞ROS生成水平及细胞凋亡率的影响。实验分6组:阴性对照组、AGEs组、GLP-1组、AGEs+GLP-1组、AGEs+p38MAPK抑制剂组、AGEs+GLP-1+p38 MAPK抑制剂组。细胞接种于6孔板,随机进行分组处理,DCFH-DA荧光探针检测细胞ROS含量,Annexin buy Pfizer Licensed Compound Library V/PI染色法检测细胞凋亡率。5.硝酸还原酶法检测e NOS抑制剂使用前后AGEs及AGEs+GLP-1处理组细胞NO生成水平。6.Annexin V/PI双染色法检测e NOS抑制剂使用前后AGEs及AGEs+GLP-1处理组的细胞凋亡率。统计学处理:数据采用SPSS 17.0进行统计分析,数据以均数±标准差(±s)表示,多组比较采用单向方差分析(One-Way ANOVA)检验,两两比较采用LSD法。P
目的:观察南美响尾蛇神经毒素(crotoxin,Cr TX)对人大细胞肺癌细胞体外培养抗肿瘤作用,以及对人大细胞肺癌细胞裸鼠移植瘤抗肿瘤作用,并探讨其相关作用机制。方法:通过四唑盐还原法(CCK-8)检测南美响尾蛇神经毒素(crotoxin)、吉非替尼(Gefinitib)及两药联合应用对人大细胞肺癌NCI-H661细胞的生长抑制率,应用细胞集落平板克隆实验观察crotoxin、gefinitib及两药联合应用对NCI-H661细胞的集落形成的影响;应用流式细胞术检测crotoxin、gefinitib及两药联合应用对NCI-H661细胞周期及细胞凋亡率的影响,并检测以SB203580抑制p38活性,以PFT-α抑制wtp53的活性后NCI-H661细胞周期及细胞凋亡率的变化;应用蛋白免疫印迹法(Western

blot)测定crotoxin、gefinitib及两药联用对NCI-H661细胞内p38MAPK、wtp53、phospho-p38MAPK、bax、bcl-2及caspase-3活性亚单位p17蛋白表达水平影响,并测定以SB203580抑制p38活性,以PFT-α抑制wtp53的活性后crotoxin、gefinitib及两药联合应用对NCI-H661细胞内以上6种蛋白表达水平变化。将人大细胞肺癌NCI-H661细胞接种裸鼠腋下建立荷瘤裸鼠模型。将荷瘤裸鼠随机分为6组,crotoxin组、gefinitib组、crotoxin+gefiniti组、crotoxin+SB203580组、crotoxin+PFT-α组和阴性对照组。实验组裸鼠腹腔注射给药,每三天给药一次,同时阴性对照组注射等量生理盐水。给药4周后完整取出皮下移植瘤结节,对比较不同干预组和对照组移植瘤瘤重,计算抑瘤率。结果:Crotoxin对NCI-H661细胞有生长抑制作用,与gefinitib联用可增强gefinitib抗肿瘤效果,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);Crotoxin对NCI-H661细胞集落形成有抑制作用,与gefinitib联用可增强gefinitib对NCI-H661细胞集落形成抑制效果,与对照组比较差异有统计学意义(P
骨质疏松症现已成为全球性的公共健康问题。成骨细胞介导骨形成和破骨细胞介导骨吸收,二者动态平衡被破坏是引发骨质疏松的内在原因。天山雪莲(Saussurea

Selleck Temozolomide involucrata Kar. et Kir, S.involucrata)是我国稀有的传统名贵药材,具有补肾活血,强筋骨,温肾助阳等功效。雪莲培养物是采用现代生物技术而获得的愈伤组织团块或细胞,其药理及功效研究是当今天山雪莲研究及开发的热点。本论文研究是以人成骨细胞MG-63为对象,探究天山雪莲细胞培养物对成骨细胞增殖、发育的影响及作用机制,以小鼠巨噬细胞RAW264.7作为破骨前体细胞,探讨其对破骨细胞形成的影响以及对成熟破骨细胞的作用。RAW264.7细胞在核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)诱导下分化为破骨细胞。雪莲培养物的加入可抑制破骨细胞的形成,并且剂量依赖性地降低抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性。对已形成的破骨细胞,乳酸脱氢酶(LDH)活性检测和Annexin V-PI双染流式细胞术结果一致,雪莲培养物可破坏破骨细胞细胞膜,增加胞外LDH酶活,诱导破骨细胞凋亡。RT-PCR结果进一步说明,天山雪莲细胞培养物通过下调TRAP和基质金属蛋白酶(MMP-9) mRNA表达抑制破骨细胞骨吸收功能。以MG-63细胞为研究对象,MTT结果表明,黄酮浓度为31.25μg/mL和62.

3%,而在同一病人的癌旁正常组织则检测不到表达或低表达。多元逻辑回归分析显示CIP2A高表达与吸烟显著相关。通过小RNA干扰(siRNA)的方法沉默CIP2A表达,能显著抑制肺癌细胞系的增殖以及克隆形成能力。在此基础上我们尝试寻找能参与调节CIP2A蛋白表达的化合物,结果我们发现中药来源的小分子化合物rabdocoetsin

B能从转录水平显著下调CIP2A蛋白,并抑制CIP2A参与调节的Akt信号通路。此外,rabdocoetsin B还可以抑制多种肺癌细胞系的增殖并诱导凋亡。有趣的是,我们还发现另外一个提取自中草药的化合物LTZ010能通过泛素-蛋白酶体通路引起CIP2A的快速降解,且具有很好的体内、外抗肿瘤活性。 总之,我们研究结果显示CIP2A蛋白可作为一个有前途的新的肺癌治疗靶点,rabdocoetsin B和LTZ010作为两个能下调CIP2A蛋白的天然化合物,具有潜在的肺癌治疗应用前景。
恶性肿瘤严重威胁人类的健康和生存状况,全世界每年600多万人死于各种恶性肿瘤,并且死亡人数呈逐年递增趋势,它的预防和治疗也已成为全球科学家共同研究的热点课题。随着对肿瘤发生机制研究的深入,作用于细胞信号转导通路的药物开始引起研究者的关注,成为抗肿瘤药物研发的重要靶点之一。其中PI3K U0126分子量 可能 (phosphatidylinositol 3-kinase)/Akt (protein

kinase B, PKB)信号通路参与调节细胞凋亡、增殖、分化和代谢等一系列生理活动,其持续的激活被认为是肿瘤细胞生长与存活的决定性因素,阻断该通路的持续活化为靶向治疗癌症提供了新策略。此信号通路的抑制剂成为肿瘤,尤其是对于由PI3K／Akt信号通路的持续活化所引起的肿瘤的潜在治疗药物。 丝氨酸／苏氨酸(Ser/Thr, serine/threonine)蛋白激酶Akt作为PI3K的下游靶标在大多数肿瘤细胞中,如卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌及白血病细胞等,都有很高的表达,当Akt被激活后可以磷酸化一系列的底物,从而阻断细胞凋亡通路,促进细胞增殖,对肿瘤的发生、发展以及转移,维持肿瘤细胞的生存具有促进作用。现在Akt抑制剂已经成为了研究热点,已报道了数种不同机理的小分子化合物,但目前还没有此类药物上市。 我们课题组基于Akt的晶体结构,对其与ATP抑制剂的结合位点进行研究分析,采用基于碎片的设计方法(fragment-based design),并且利用计算机AutoDock 4.0软件辅助设计,将含氢键受体的基团,含氢键供体狭长的基团以及含氨基的基团连接于平面芳香结构上,设计合成一系列4-苯乙烯吡啶结构的化合物。 目标化合物的合成以取代水杨醛为原料,通过缩合反应、水解反应、醚化反应、酰化反应、Sonogashira反应、氨基的保护及脱保护等一系列反应而得。合成的化合物均未见文献报道,其结构通过了MS、IR以及1H-NMR谱确证。同时我们测定了目标化合物对K562肿瘤细胞的抑制活性,结果显示多数化合物具有较好的细胞抑制活性。其中,化合物vii-5的活性最好,IC50为4.34±1.04μM,化合物vii-4的活性次之,IC50为6.35±2.83μM。下一步将测定化合物对Akt激酶的抑制活性。 初步构效关系表明,反-4-苯乙烯基吡啶母环上的吡啶基是活性必须基团；当苯环上的氨基侧链为柔性链,且不在紧邻氨基处接刚性环时,活性都较好；当这条侧链的对位被氯或溴原子取代时,化合物活性也会提高。 这些研究结果为进一步结构优化、筛选候选药物奠定了基础。
Notch、Wnt和Hh信号通路均参与了三阴性乳腺癌的发生发展。Aurora激酶A、Chk1、miR-93等在三阴性乳腺癌中存在过表达,并与其预后相关,为其治疗提供了新靶点。
Pancreatic

不 ductal adenocarcinoma(PDA)is among the deadliest cancers in the United States and in the world.Late diagnosis,early metastasis and lack of effective therapy are among the reasons why only 6%of patients diagnosed with PDA survive past 5 years.Despite development of targeted therapy against other cancers,little progression has been made in the treatment of PDA.Therefore,there is an urgent need for the development of new treatments.However,in order to proceed with treatments,the complicated biology of PDA needs to be understood first.Interestingly,majority of the tumor volume is not made of malignant epithelial cells but of stroma.

JNK通路介导软脂酸对Mcl-1的负向调节。 结论 本研究发现软脂酸诱导肝细胞凋亡过程中Mcl-1的蛋白水平显著下调,并进一步明确软脂酸诱导肝细胞凋亡主要是通过激活JNK通路、促进Mcl-1下调实现的,提示JNK/Mcl-1途径在软脂酸诱导的肝细胞脂性凋亡过程中具有重要作用。本研究为深入理解非酒精性脂肪肝发病机制提供新的线索,并为该病的治疗提供新的潜在靶点和策略。
肝纤维化(

hepatic fibrosis)是机体对慢性肝损伤的一种修复反应,是一种渐进的病理过程,是慢性肝病的共有病理变化,是多种类型细胞、氧化应激、细胞因子和生长因子等一系列复杂作用的结果。肝纤维化的特征改变是肝脏内细胞外基质( extracellu2larmatrix, ECM)的过度增生和异常沉积,如不加以及时治疗,将引起严重的肝纤维化并导致肝硬化,甚至引起肝功能衰竭。肝纤维化已成为一个危害人类生命健康的世界性问题,如果能阻止其发生,肝硬化及其并发症就能得到有效控制。近年来国内外研究认为,肝星状细胞(hepatic Caspase inhibitor stellate cell,HSC)是肝纤维化时过量ECM的主要来源,激活的HSC大量增殖,发生表型改变并分泌更多的ECM沉积于肝脏,是肝纤维化形成的关键。目前从肝纤维化发生发展的不同环节入手研制了许多抗纤维化药物,但仍未有十分确定、特效的药物,因此,寻找理想的抗肝纤维化药物及有关肝纤维化发病机制的阐明,具有重要的理论和临床意义。 苦参素(oxymatrine,OM),又名氧化苦参碱,是苦参碱经氧化合成、纯化、提取而得到的有效单体,是苦参碱的N-氧化物,氧化苦参碱因具有特殊的氧结构,从而使分子极性大增,较苦参碱具有独特的作用机理和疗效。以往的研究证实苦参素具有调节免疫、抗炎和抗肿瘤等多种功效。近年又有研究表明,OM具有抗乙肝及防治肝纤维化的作用,引起关注。本实验采用四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型,首先从整体水平考察了OM对大鼠肝纤维化的作用;进一步在体外从细胞和分子水平探讨OM抑制HSC增殖的分子机制,观察OM对TGF-β1刺激HSC-T6增殖的影响,探讨MAPK信号转导通路与TGF-β1/smads信号通路在TGF-β1刺激HSC-T6增殖中的作用及相互关系,以企探讨OM的作用机制。

Fulvestrant 价格 本研究内容包括以下两个部分 一. OM对CC14诱导的大鼠肝纤维化的保护作用 建立CC14诱导的大鼠肝纤维化模型,设立正常组、模型组、OM给药组(30mg?kg-1, 60mg?kg-1, 120mg?kg-1)、秋水仙碱阳性对照组(0.2 mg?kg-1)。结果显示,OM对CC14诱导的大鼠肝纤维化具有良好的保护作用。模型组HA,LN, CIV,PCIII等纤维化血清学标志物水平较正常组明显升高,给予OM(60mg?kg-1, 120mg?kg-1)后可使其显著降低。肝纤维化的另一个重要指标肝组织Hyp含量的检测结果显示,OM可显著降低模型组的Hyp值。组织病理学结果表明OM可明显的抑制肝纤维化程度,改善肝组织结构,减少胶原沉积。 模型组大鼠肝匀浆中SOD和GSH-Px酶活性显著下降,而MDA含量显著升高。给予(30mg?kg-1,

AG-014699 价格 60mg?kg-1, 120mg?kg-1)后可显著降低升高的MDA值,并显著升高SOD和GSH-Px活性。提示OM可缓解肝纤维化大鼠肝脏的氧化应激状态。 实验观察了OM对模型大鼠肝组织中α-SMA、TGF-β1、smad2、smad3、smad7mRNA的表达含量的影响,RT-PCR检测结果显示OM治疗后模型大鼠肝组织α-SMA、TGF-β1、smad2、smad3含量明显降低,smad7则有所上升。 在肝纤维化模型大鼠中,p38、JNK、ERK1/2磷酸化程度明显增加,给予OM可以有效降低肝纤维化大鼠p38、JNK、ERK1/2磷酸化的程度。 二探讨OM抗肝纤维化的分子机制 1苦参素对TGF -β1刺激的HSC-T6增殖的抑制作用 建立体外TGF-β1诱导的HSC-T6模型,OM在0.01,0.1,1,10,100mg·L-1浓度可抑制HSC-T6增殖,抑制率与OM浓度呈浓度依赖性。 2.苦参素对TGF -β1刺激的HSC-T6 p38MAPK信号通路的影响 Western blot检测结果显示,TGF -β1刺激HSC-T6可引起p38MAPK的迅速磷酸化,OM可显著抑制TGF -β1刺激的HSC-T6 p38MAPK的激活,明显降低p38磷酸化水平。提示抑制TGF-β1刺激的HSC-T6 p38MAPK磷酸化是OM抗肝纤维化的作用机制之一。 3.苦参素对TGF -β1刺激的HSC-T6 TGF–β1/smads信号通路的影响 Western blot检测结果显示,随TGF-β1刺激HSC-T6时间的递增,TβRI, smad2,Smad3蛋白表达递增,Smad7则有所降低。 OM可显著抑制TGF-β1刺激的HSC-T6 TβRI,smad2, Smad3蛋白的表达,上调Smad7的表达。提示抑制TGF–β1/smad通路是OM抗肝纤维化的作用机制之一。 4.

活动期Vogt-小柳原田综合征患者体内MDMs细胞线粒体受损及ROS产生水平与静止期Vogt-小柳原田综合征患者、AAU患者和正常人相比明显升高；poly I:C和LPS可以使各组MDMs细胞线粒体受损及ROS产生水平明显增高，并且活动期Vogt-小柳原田综合征患者升高水平明显高于其它组；anti-TLR3/anti-TLR4可以明显降低poly I:C/LPS对MDMs细胞线粒体损伤和ROS产生的作用；rotenone可以明显升高MDMs细胞ROS产生水平及IL-1β产生水平，而DPI可以明显降低MDMs细胞ROS产生水平及IL-1β产生水平。 查找更多 4.基因沉默炎症小体NLRP3后，各组IL-1β产生水平显著降低。 5. ROS通过激活p38和ERK1/2信号通路进而激活炎症小体NLRP3，从使IL-1β产生增多。

结论： 我们的结果显示：TLR3/4在活动期Vogt-小柳原田综合征患者MDMs细胞中表达明显升高。TLR3/4与其配体poly I:C/LPS相互作用可以通过使线粒体产生ROS增多，激活炎症小体NLRP3，进而使IL-1β产生增多引起炎症反应。
紫锥菊(Echinacea purpurea)是近年来备受关注的一种安全、高效多功能药用植物,其具有强大的免疫调节活性。巨噬细胞和树突状细胞(dendritic cell, DC)同为机体免疫系统的重要成员,前者具有吞噬、分泌、组织修复、抗原递呈等多种功能,后者为专职抗原提呈细胞并能分泌多种细胞因子,两者均在非特异性免疫(先天性免疫)和特异性免疫(获得性免疫)中有重要作用。Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)主要表达于巨噬细胞和DC,该类受体在识别配体后,既能够通过激活炎症因子和I型IFN分泌,启动非特异性免疫反应,又可以通过促进DC成熟并递呈抗原,启动特异性免疫反应。因此,本研究拟先以小鼠为研究材料,探讨紫锥菊提取物(Echinacea purpurea extract, EE)对其机体免疫功能和抗沙门氏菌感染能力的影响,再以小鼠巨噬细胞和DC为研究对象,研究EE对两者免疫功能的影响以及TLR信号通路在此免疫调节活动中的作用,最终结合两方面的研究结果,阐明EE调控小鼠细胞和机体免疫功能以及抗沙门氏菌感染能力的机理。主要研究内容及结果如下：

(一)EE对小鼠机体免疫功能和抗沙门氏菌感染能力的影响 50只体重相近的C57BL/6雌性小鼠被随机分为5组,对照组、EE组、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium, ST)组、EE+ST组和庆大霉素(gentamycin, GM)+ST组,每组10只。对照组、EE组分别以PBS和EE AZD6738 solubility dmso (10mg)连续灌胃17天,研究EE对正常小鼠机体免疫功能的影响；ST组、EE+ST组和GM+ST组分别以PBS、EE (10mg)和PBS连续灌胃17天,并于第15天再灌胃5×10~8CFU ST感染小鼠,研究EE对小鼠机体抗沙门氏菌感染能力的影响。结果如下：

EE对正常小鼠机体免疫功能的影响：(1)EE对正常小鼠生长和肠粘膜结构无显著影响,说明其对小鼠机体具有良好的安全性；(2)EE可显著提高小鼠机体免疫功能,提高其脾脏指数；(3)EE可在一定程度上可增强小鼠机体的抗体分泌功能,增加小肠分泌型IgA (secretory IgA, sIgA)分泌,但对IgG分泌没有影响；(4)EE可增强小鼠机体的非特异性免疫功能,显著上调小鼠血液、回肠、结肠、脾脏、肠系膜淋巴结(mesenteric lymph node, MLN)和肝脏中促炎细胞因子白介素(interleukin, IL)-6、IL-12、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor, TNF)-α、干扰素(interferon, IFN)-γ和抑炎细胞因子IL-10的表达并显著增加其回肠和结肠的NO产生。 哪里 EE对小鼠机体抗沙门氏菌感染能力的影响：(1)EE可缓解ST感染对小鼠机体和免疫系统的损伤,消除鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium, ST)感染引起的小鼠体重下降,大幅减轻ST感染引起的肠粘膜损伤以及脾脏肿大和CD4+/CD8+值下降；(2)EE可降低肠粘膜的ST感染程度,显著减少回肠和结肠粘膜的中性粒细胞浸润以及ST在结肠的定植和ST向肝脏和脾脏中的移位；(3)EE可增强ST感染小鼠机体的抗体分泌功能,显著促进IgG和sIgA分泌；(4)EE可增强ST感染小鼠机体的非特异性免疫功能,显著上调血液、脾脏、MLN和肝脏中促炎细胞因子IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-y和抑炎细胞因子1L-10的表达并显著增加其回肠和结肠的NO产生。 以上结果提示,EE能够通过增强小鼠的机体免疫功能,提高其抗感染能力。 (二)EE对小鼠巨噬细胞免疫功能的影响 本研究分别以200μg/mL和100μg/mL EE处理RAW264.7小鼠巨噬细胞系和骨髓源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage, BMDM),研究EE对两者免疫功能的影响。结果如下： EE对RAW264.7小鼠巨噬细胞系免疫功能的影响：(1)EE对RAW264.7细胞的安全浓度为0-200μg/mL;(2) EE可激活RAW264.7细胞,显著提高酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)和乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)活性；(3)EE可增强RAW264.7细胞的吞噬功能；(4)EE可增加RAW264.7细胞的细胞因子分泌,显著上调促炎因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ抗炎因子IL-10、转化生长因子(transforming growth factor, TGF)-β1和抗病毒细胞因子IFN-p的基因表达和分泌；(5)EE可增强RAW264.

无论在体内还是在体外,5-FU半乳糖苷对肿瘤生长均具有显著抑制作用,呈现良好的肿瘤靶向性,与5-FU相比,不仅疗效显著增加,且毒性明显降低,提示良好的抗肿瘤作用。
研究现状与目的:慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B,CHB)是威胁人类健康的传染病之一,主要是由乙肝病毒持续感染引起。乙肝病毒是嗜肝病毒,主要通过免疫损伤引起肝细胞的破坏,如不及时清除将会引起肝脏反复的炎症,最终导致肝硬化,甚至肝癌。 迄今为止,乙型肝炎慢性化的发病机制尚不十分清楚,许多研究已经证实慢性乙型肝炎(chronic ABT-199订单 viral hepatitis B,CHB)的发病机制与机体的细胞免疫功能低下密切相关,但CHB患者细胞免疫功能低下的机制尚未完全阐明。近年来,T淋巴细胞“激活诱导细胞死亡(activation induced cell death, AICD)”与慢性乙型肝炎的关系已引起人们的高度关注。AICD是指一种再活化淋巴细胞的凋亡,即已活化的成熟淋巴细胞(T或B)再次受到激活信号(特别是TCR/CD3复合体)激活后,诱导自身Fas及FasL、TNF及其配体等凋亡效应因子的表达,通过配体-受体的相互作用,传递细胞凋亡信号,导致细胞自身凋亡。外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,

PBMCs)主要由淋巴细胞组成,还包括单核巨噬细胞及自然杀伤细胞等免疫活性细胞,在机体的免疫反应尤其是细胞免疫反应中起重要的作用,检测PBMC凋亡状况可大体反映外周血淋巴细胞凋亡状况。有研究发现CHB患者外周血淋巴细胞和PBMC发生AICD的比率比正常人高,提示HBV可能通过诱导PBMC凋亡增多,造成免疫细胞数量减少或活性下降,使CHB患者免疫功能低下,而使HBV感染得以持续,所以由HBV所致的淋巴细胞活化后诱导凋亡过多可能是造成乙肝慢性化及形成免疫耐受的重要的机制之一,但是其凋亡机制目前尚不清楚。因此如何减少CHB患者PBMC的AICD,改善CHB患者的细胞免疫功能,将是打破免疫耐受状态、清除慢性乙型肝炎患者体内HBV的可能途径。目前关于其凋亡途径的研究主要集中于由Fas/FasL等介导的死亡受体凋亡途径和Bcl-2家族调控的线粒体凋亡途径,认为死亡受体途径和线粒体途径可能在CHB患者PBMC的AICD过程中起着重要的作用。

PI3K(phosphatidylinositoI3-kinase,磷脂酰肌醇3-激酶)/PKB (protein kinase B,蛋白激酶B)信号通路在抑制细胞凋亡方面起着至关重要的作用。FOXO3a(FKHRL1)是PI3K/PKB信号转导途径下游重要的靶基因,是Forkhead转录因子家族成员之一。未被磷酸化的FOXO3a(FKHRL1)存在于细胞核中,通过激活促凋亡基因(FasL、TRAIL、Bim等)的转录,介导死亡受体途径和线粒体途径的凋亡。一旦被PKB磷酸化, FOXO3a就离开细胞核,失去其转录活性。细胞受到细胞外信号刺激后,使细胞膜上的PI3K活化,活化的PI3K可以使PKB磷酸化激活(即p-PKB),p-PKB可以使促凋亡转录因子FOXO3a(FKHRL1)磷酸化失活,磷酸化的FOXO3a与DNA亲和力下降,从细胞核转移至细胞质,并与细胞质中的伴侣蛋白14-3-3蛋白结合,阻止FOXO3a蛋白逆转运至细胞核内,从而抑制FOXO3a的转录活性,抑制其对下游促凋亡基因Bim的转录和翻译,抑制促凋亡蛋白Bim的表达,发挥抑制细胞凋亡的作用。有研究发现在T淋巴细胞的AICD过程中,激活PI3K/PKB信号通路可以降低淋巴细胞的AICD,而抑制PI3K/PKB信号通路可以促进淋巴细胞AICD的过程。PI3K/PKB信号通路是否参与了CHB患者PBMC的AICD过程,目前此方面的研究尚无报道。为此,我们以CHB患者PBMC为研究对象,体外模拟AICD过程,观察PI3K/PKB信号通路中p-PKB,总PKB及其下游的FOXO3a转录因子、Bim蛋白的表达情况和PBMC的凋亡率,以及被激活剂胰岛素样生长因子-1 不 (insulin-like growth factor-1, IGF-1)激活PI3K/PKB信号通路后,上述蛋白的表达和PBMC凋亡率的变化,探讨PI3K/PKB信号通路对慢性乙型肝炎患者AICD的影响,为慢性乙肝的治疗提供一定的理论基础。 方法: 1入选标准和排除标准:选取慢性乙型肝炎患者共40例,其中男性22例,女性18例,年龄在18岁-60岁之间,平均年龄35岁,随机分成两组,慢性乙肝组和慢性乙肝+激活剂组。慢性乙型肝炎患者HBVDNA均阳性(1×103copies/ml≤HBVDNA≤1×107copies/ml),肝功能异常,ALT高于正常值上限2倍以上,诊断标准符合2005年中华医学会制定的“慢性乙型肝炎防治指南”,乙型肝炎标志物HBsAg阳性、HBeAg或抗-HBe阳性和抗-HBc阳性。排除HAV、HCV、HDV、HEV和HIV感染,排除近3个月应用糖皮质激素、干扰素等影响免疫功能药物的患者,除外应用抗病毒药物治疗的患者,及近期有急性感染患者。健康对照20例,男12例,女8例,年龄在18岁-45岁,平均年龄30岁,取自健康献血员。

BVD-523核磁共振 2 PBMC提取、培养:无菌条件下抽取肝素抗凝血4mL,应用密度梯度 离心法分离PBMC分离成功的PBMC加入植物血凝素(Phytohemagglutinin, PHA)100μg/ml刺激培养16-18小时,弃去PHA,加入外源性IL-2 1000U/L进行培养至少5天后,用抗CD3抗体500ug/ml重新刺激48小时。其中慢性乙肝+激活剂组用抗CD3抗体重新刺激之前加入IGF-1(insulin like factor-1)100ng/ml预处理20分钟。 3细胞凋亡的检测 培养的细胞用70%乙醇固定,4℃离心去掉固定液,并用冷PBS洗2次,加入含有RaseA的PI染液约1000μL,室温静置30分钟后上流式细胞仪检测凋亡率。 4 p-PKB、总PKB、p-FOXO3a和Bim蛋白的检测 剩余细胞,提取蛋白后,-80℃保存,待收集够标本后集中行Western blot检测p-PKB、总PKB、p-FOXO3a和Bim蛋白的表达情况。 结果: 1经抗CD3抗体刺激48h后,慢性乙肝组外周血单个核细胞凋亡率(28.27%±4.61%)高于健康对照组(19.36%±5.90%),差异有统计学意义(P<0.05)。也高于慢性乙肝+激活剂组(22.69%±3.47%),差异有统计学意义(P<0.05)。慢性乙肝+激活剂组凋亡率(22.69%±3.47%)高于健康对照组(19.36%±5.

31%(46/58),不良反应发生率为5.17%(3/58),均明显优于对照组患者(P<0.05...
目的探讨VENTANA全自动免疫组化法(VENTANA IHC)和手工免疫组化法(手工IHC)检测肺腺癌中间变性淋巴瘤激酶(ALK)突变的差异性。方法采用VENTANA IHC和手工IHC分别检测120例肺腺癌患者肿瘤组织中ALK基因突变,并用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行验证。结果在120例病例中,采用VENTANA IHC、手工IHC和RT-PCR检测,EML4-ALK阳性的例数分别为14例(11.7%)、19例(15.8%)和15例(11.6%)。与RT-PR相比较,VENTANA IHC检测的敏感性和特异性分别为93.3%和100%,二者之间的总符合率为99.1…
2011年在恶性肿瘤治疗方面是一个特殊的年份。40年前美国总统作出了”对癌症的战争”国家的宣言。从政府层面上对癌症研究及临床诊治进行了非常大的投资。如今癌症患者的存活率已得到显著的增加,三分之二的患者存活达五年以上。今年,美国临床肿瘤学会公布了54个重要的肿瘤临床研究,其中多项重大进展引起大家的关注。
肺癌是全球最常见的癌症之一,2008年有160万新增病例,而每年有138万人死于肺癌(占癌症总死亡人数的18.2%)。肺癌是我国发病率最高的癌症,年发病率为35/10万(即每十万人就有35人患肺癌),其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占80%。2012年中国肿瘤登记年报显示肺癌发病率和死亡率均为第一位,并且其发病率和死亡率呈几个特点:第一,发病率和死亡率在不断增长;第二,发病年龄年轻化;第三,女性肺癌发病增长比较明显;第四,肺腺癌增长比较明显;第五,早期诊断率与过去二十年比较提高得不多。目前,NSCLC治疗使用的一线治疗是基于铂类化合物的联合治疗,即
肺癌是我国常见和死亡率最高的恶性肿瘤,非小细胞肺癌(Non-small

Lumacaftor订单 Cell LungCancer,NSCLC)是肺癌中最常见的类型。临床上就诊的非小细胞肺癌,约30%为早期,20%为局部晚期,50%为晚期。一般而言,早期肺癌以手术治疗为主,局部晚期为化放疗
目的在晚期非小细胞肺癌(NSCLC)中,c-Met扩增和T790M突变是EGFR-TKIs获得性耐药最常见的两种分子生物学机制。而c-Met过表达能否作为获得性耐药患者靶向治疗的生物标志物目前尚不清楚。方法晚期非小细胞肺癌(NSCLC)EGFR-TKIs获得性耐药的患者,采用IHC的方法检测c-Met
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Objective: NLG919 The echinoderm microtubule-associated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase (EML4-ALK) UMI-77临床实验 fusion oncogene defines a novel molecular subset of non-small cell lung cancer
近年来,分子靶向抗肿瘤药物的学术价值、社会效益及经济效益得到不断体现和确证,已经成为当今国际抗肿瘤药物研究和开发的主流。分子靶向药物是区别于传统细胞毒类药物的新型抗肿瘤药物,主要作用于在正常细胞和肿瘤细胞中差别巨大的调控细胞增殖生长的关键分子及其信号转导通路,具有对肿瘤的选择性高、毒
In spite of a worldwide decrease in the incidence of gastric cancer, this malignancy still remains

one of the leading causes of cancer mortality. Great efforts have been made to improve treatment outcomes in patients with metastatic gastric cancer, and the introduction of trastuzumab has greatly improved the overall survival. The trastuzumab treatment took its first step in opening the era of molecular targeted therapy, however several issues still need to be resolved to increase the efficacy of targeted therapy. Firstly, many patients with metastatic gastric cancer who receive trastuzumab in combination with chemotherapeutic agents develop resistance to the targeted therapy.

测定原理为过氧化脂质降解产物中的丙二醛(MDA)可与硫代巴比妥酸(TBA)缩合,从而形成红色产物,在532nm处有最大吸收峰。6 RT-PCR检测p38MAPK、SGK1、NFAT5和HO-1mRNA表达情况首先从脊髓细胞中提取总RNA,鉴定RNA纯度和浓度。应用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。之后采用sybr green法检测扩增变化。采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。计算方法是：目的基因相对表达倍数=2-△△C(t),c(t)值是热循环仪中荧光达到荧光阈值的循环数,根据△c(t)实验组=C(t)目的基因-c(t)ACTIN,△c(t)对照组=c(t)目的基因-c(t)ACTIN,△△c(t)=Δc(t)实验组-△c(t)对照组,对每一标本计算目的基因相对于对照组基因的相对定量结果。即其他各个样品相对于对照样品,目的基因mRNA转录水平的差异。7统计方法采用SPSS19.0统计软件进行统计分析。实验所测得数据进行正态性检验和方差齐性检验,以“均数±标准差”表示。发病率用用卡方检捡进行统计学分析,以百分比表示。多组计量资料均数的比较：方差齐时应用ONE-WAY-ANOVA中SNK-q检验进行方差分析,方差不齐时立用非参数秩和检验。以P
研究背景：骨肉瘤(Osteosarcoma)源于间叶组织,是以能产生骨样组织的梭形基质细胞为特征的恶性肿瘤,是原发性恶性骨肿瘤中最常见、恶性程度最高的一类骨肿瘤,好发于儿童和青少年期。在手术切除的基础上辅助阿霉素(Adriamycin,

购买Screening Library研究 ADR)药物为主的联合化疗是目前临床主要治疗手段。尽管新型辅助化疗的应用极大地提高了骨肉瘤患者的5年存活率,但是骨肉瘤患者的预后一直很差,长期生存率仍徘徊不前。骨肉瘤易复发、易转移及患者对包括阿霉素在内的化疗药物产生原发或继发性耐药是目前导致临床化疗失败的主要原因。根据肿瘤干细胞理论,骨肉瘤肿瘤干细胞具有自我更新、强致瘤性、多向分化潜能、产生异质性肿瘤细胞及多重耐药性的生物学特征,因此骨肉瘤肿瘤干细胞的存在可能是临床化疗失败的关键原因之一。如果可以特异性的针对骨肉瘤肿瘤干细胞,尤其是化疗作用下骨肉瘤肿瘤干细胞相关特性的改变,可为深入认识骨肉瘤的发生发展提供新方向,并以此为基础寻找和发现靶向骨肉瘤肿瘤干细胞的药物,对于骨肉瘤的最终治愈具有不可估量的前景和价值。本论文通过考察一线化疗药物阿霉素对骨肉瘤肿瘤干细胞特性和转移能力的影响,发现人类Kruppel样因子4(K1f-4)是促进骨肉瘤肿瘤干细胞特性和转移能力的重要调控因子,进一步通过研究其调控骨肉瘤肿瘤干细胞特性和转移能力的作用及其分子机制,进而揭示调控骨肉瘤发生发展、转移和耐药等特性的新的关键因子；最后以Klf-4蛋白为潜在靶点筛选到以辛伐他汀为代表的他汀类药物能够抑制Klf-4蛋白,进而有效地拮抗了阿霉素促进的骨肉瘤肿瘤干细胞特性和转移能力作用,为骨肉瘤的靶向治疗策略提供全新的思路。第一部分：阿霉素影响骨肉瘤细胞的干细胞特性及肿瘤转移能力的作用及机制研究一.研究目的：虽然包括辅助化疗和新辅助化疗在内的化疗方案的引入极大地提高了骨肉瘤患者的5年生存率,但是骨肉瘤患者的预后一直很差,长期生存率一直徘徊不前。骨肉瘤易复发、易转移及患者对包括阿霉素在内的化疗药物产生原发或继发性耐药是目前导致临床化疗失败的主要原因。根据肿瘤干细胞理论,骨肉瘤肿瘤干细胞的存在可能是其化疗失败的关键因素,目前针对骨肉瘤化疗与肿瘤干细胞具体关系尚未见报道。本课题旨在研究骨肉瘤一线化疗药物阿霉素(Adriamycin,

ADR)与骨肉瘤肿瘤干细胞特性及肿瘤转移能力的关系,阐明其作用机制,为临床靶向治疗骨肉瘤提供潜在靶点。二.研究方法：SRB法检测骨肉瘤细胞对药物的敏感性；siRNA干扰手段沉默目标蛋白；Western

购买PR-171 哪里 Blotting检测蛋白表达、qRT-PCR检测基因表达；流式细胞术检测干细胞标记物CD133的表达；肿瘤微球形成实验考察细胞的自我更新能力；细胞划痕修复和Transwell小室模型考察细胞迁移运动能力。三.研究结果：1.ADR对骨肉瘤肿瘤干细胞特性的影响：1)ADR可抑制骨肉瘤细胞的增殖能力且呈良好的剂量关系和时间关系；2)ADR能够引起KHOS/NP、U2OS和OS20三株骨肉瘤细胞的干细胞标记物CD133阳性表达率增加；3)ADR处理组的骨肉瘤细胞形成sphere的数目明显高于对照组；4)ADR作用能够显著提高骨肉瘤肿瘤干细胞标记物CD 133、ALDHA1和ABCG2的转录水平。2.ADR对骨肉瘤细胞转移能力的影响：1)ADR处理组的骨肉瘤细胞划痕修复能力显著高于对照组；2)ADR处理组的骨肉瘤细胞迁移至Transwell下室的细胞数目显著高于对照组。3.ADR对干细胞转录因子的影响：1)ADR作用骨肉瘤细胞后能够选择地激活Klf-4的mRNA转录；2)ADR作用骨肉瘤细胞后能够上调Klf-4蛋白表达水平。4.Klf-4对ADR促进的骨肉瘤肿瘤干细胞特性的影响：1)沉默Klf-4能够明显抑制ADR引起的CD133表达增加；2)沉默Klf-4能够明显减少ADR所引起sphere数目增加；3)沉默Klf-4能够明显减少A_DR促进的肿瘤干细胞标记物CD133、 ALDHA1和ABCG2的mRNA表达。5.KIf-4对ADR促进的骨肉瘤细胞转移能力的影响：1)沉默Klf-4能够抑制ADR引起的骨肉瘤细胞划痕修复能力增强；2)沉默Klf-4能够明显减弱ADR引起的骨肉瘤细胞迁移运动能力增强。四.研究结论：本研究首次发现一线化疗药物ADR能够增强骨肉瘤细胞的肿瘤干细胞特性及肿瘤转移能力,且这种作用依赖于Klf-4的蛋白水平的上调。本研究从肿瘤干细胞角度为解释患者在接受阿霉素治疗的过程中出现骨肉瘤的复发和转移现象提供了新视角。第二部分Klf-4调控骨肉瘤肿瘤干细胞特性及转移能力的作用研究一.研究目的：人类Kruppel样因子4(Klf-4)是Spl/Kruppel样锌指转录因子家族的成员之一,参与调控细胞增殖、分化、胚胎发育等重要生命过程。与已知的TGF-β一样,Klf-4在不同的遗传背景的细胞中具有癌基因或者抑癌基因的不同功能,而Klf-4对骨肉瘤的调控作用尚未见任何文献报道。第一部分研究显示Klf-4参与调控ADR对骨肉瘤肿瘤干细胞特性和转移能力的影响,提示Klf-4可能可以作为靶向骨肉瘤肿瘤干细胞的潜在靶点,本课题将进一步研究Klf-4在骨肉瘤中的表达水平与其自身恶性程度的可能关系以及其在骨肉瘤干细胞样模型中的表达,并以此为切入点,较为全面地阐明其与骨肉瘤肿瘤干细胞特性和转移能力的相互关系,从而揭示调控骨肉瘤发生发展、转移和耐药的关键因子,为骨肉瘤的治疗提供新的潜在分子靶点,有望进一步推动骨肉瘤的临床治疗。二.

挑选人类正常胃粘膜上皮细胞株GES-1以及六个胃癌细胞株(AGS、SGC7901、 MKN45、MKN28、BGC823、NCI-N87)。使用实时定量RT-PCR检测不同细胞株中PUMA mRNA的表达水平。 2.用Western Blotting方法检测上述七种细胞株中PUMA蛋白表达水平。 3.收集24例胃癌组织标本,使用实时定量RT-PCR检测胃癌组织与癌旁正常组织中PUMA mRNA表达水平。 4.通过搜索www.oncomine.org数据库,应用Mann-Whitney test、Logrank test、 Cox’s regression model等统计学方法分析PLMA基因与胃癌临床特征的关联性。 5.应用携带有PUMA基因的质粒转染MKN28和SGC7901这两种胃癌细胞株,然后通过MTS法及流式细胞术分析PUMA基因表达增加对胃癌细胞增殖能力及凋亡的影响 6.应用SiRNA敲减GES-1胃癌细胞中PUMA基因的表达,并通过MTS法检测分析PUMA基因表达减少对胃癌细胞增殖能力的影响。 结果： 1.与正常胃粘膜上皮细胞株相比,在大多数胃癌细胞株中,PUMA基因无论在mRNA还是在蛋白质水平均表现为明显的表达下调；此外,与癌旁正常组织相比,胃癌组织中PUMA mRNA表达水平也表现为显著下降(P
长期以来,我国的创新药物研发事业远远落后于世界领先水平,由于绝大多数重大疾病的药物专利权都握在欧美公司的手中,不仅广大同胞的病痛难以得到及时有效的治疗,我们还不得不面对以巨大的药物消费市场来换取微薄利润的尴尬局面。因此,研发具有自主知识产权的创新药物势在必行。然而,创新药物研发项目具有投资巨大、技术门槛高、周期长、风险很高的特点。这一行业在我国才刚刚起步,面临着融资困难、经验不足、产业化缓慢和专业人才匮乏等困难,还没有形成自身成功的管理体系。

本文正是想通过创新药物研发企业的国际比较,总结发达国家能够成功创制新药的一些关键因素,找出我们落后的原因所在,分析在国内现有经济环境下,这类项目能够取得成功的管理方法。文章分别从核心技术平台的搭建、项目组合管理战略、具体项目运作三个不同层面,逐层进行分析论证,建设性的提出一套可行的项目管理方法。在技术战略层面,搭建产学研一体化完整整合的核心技术平台是关键：包括平台搭建的关键影响因素,组织模块构建,以及各模块如何有效的整合运作。在企业战略层面,根据研发管线,短期项目、中期项目、长期项目相结合的项目组合管理是关键：即短期获得生存与发展的项目战略,中期持续增长的项目战略,长期高额利润的项目战略。在项目运作层面,将项目管理的工具方法合理有效的运用是关键：包括项目的选题立项、筹备启动、组织管理、进度控制、风险管理、结题验收等。

还有 查找更多 随着国家“十二五”重大新药创制项目的不断推进以及一系列鼓励创新政策的出台,创新药物研发事业在我国正是方兴未艾,在未来十年必将迅速发展并取得突破性进展。在这一国内新兴领域的早期开发探索阶段,总结论证出一些在当下国内的经济环境下,创新药物研发项目能够获得成功的管理方法,给行业中的其它企业带来一些借鉴和帮助,推动这一行业的发展,正是本文的核心价值所在。
背景和目的 中药藤黄取自藤黄科植物藤黄树分泌的干燥树脂,性寒,味酸、辛、涩,主治痈疽肿毒,顽癣恶疮。藤黄酸(gambogic acid,GA)是中药藤黄主要的抗肿瘤活性成份,现代中药学研究证实其具有广谱抗肿瘤活性,有效抑制包括肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌等肿瘤细胞的生长。GA通过促进肿瘤细胞凋亡、抑制端粒酶活性、诱导细胞G2/M期阻滞、抑制核膜孔蛋白表达、抑制血管生成、激活T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞等途径发挥抗肿瘤活性,但GA抑制p53野生型非小细胞肺癌细胞增殖的分子机制尚未完全阐明。 本研究以p53野生型非小细胞肺癌细胞株A549为研究模型,观察GA对细胞生长的抑制作用,分析GA干预对非小细胞肺癌细胞ROS含量、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,△ψm)、细胞凋亡率的影响,检测p53及其下游促凋亡靶基因Bax、Bik和PUMA表达的变化情况,探讨GA诱导非小细胞肺癌A549细胞凋亡的分子机制。进一步应用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,

NAc)预处理A549细胞,分析清除内源性ROS对GA诱导A549细胞凋亡、表达p53及凋亡相关蛋白的影响；深入研究ROS在GA调控p53表达诱导A549细胞凋亡中的作用。 许多 实验方法 体外培养p53野生型非小细胞肺癌A549细胞,MTT法观察不同浓度GA干预细胞24、48和72h对其增殖的影响；Annexin V-FITC/PI双染法分析GA干预A549细胞24h凋亡率的变化；DFCH-DA法分析GA干预A549细胞2h胞内ROS的含量；JC-1探针染色分析GA干预16h后A549细胞线粒体膜电位的变化；Westernblot实验分析GA干预对A549细胞表达p53及其下游靶基因Bax、Bik和PUMA的影响,及抗凋亡蛋白Bcl-2、caspase级联反应蛋白表达的变化。 我们进一步应用抗氧化剂NAc预处理2h清除内源性ROS,分析GA对A549细胞凋亡率、p53及凋亡相关蛋白表达的影响。 结果 GA呈剂量-时间依赖关系抑制A549细胞的增殖,不同浓度(0.5、1、2.5、5和10μM)GA干预24h,存活率分别为98.3%±4.8%、92.7%±4.0%、73.1%±5.2%、42.6%±3.7%和21.5%±3.8%；干预48h,存活率分别为96.2%±5.4%、84.5%±4.6%、62.6%±4.8%、21.8%±5.0%和12.7%±3.6%；干预72h,存活率分别为95.4%±6.1%、80.2%±5.7%、43.5%±4.3%、18.6%±4.8%和10.3%±2.9%。Annexin V-FITC/PI双染结果显示,2.5、5和10μMGA干预A549细胞24h的凋亡率分别为22.4%±5.7%、40.0%±6.2%和66.6%±5.

001)，第21位丝氨酸残基磷酸化增加了2.1倍(P＜0.05)，而磷酸化的增加伴随着转录活性的下降。与PPARα磷酸化水平的提高相对应，细胞外信号调节激酶ERK1和ERK2的磷酸化也分别增加了14倍(P＜0.001)和4.1倍(P＜0.01)，提示ERK-MAPK信号转导通路可能介导了PPARα的磷酸化。与此相呼应，ERK1／2抑制剂的处理使得AR诱导的PPARα转录活性的抑制被显著改善(达到对照的78％，P＜0.001)，而P13K、p38、JNK及PKC抑制剂处理则没有此作用。特别重要的是，用25 EPZ5676 mM浓度的葡萄糖处理AML12细胞也获得了与上述效应相似的结果。与在5

mM葡萄糖浓度下培养相比，25 mM葡萄糖的处理使得AML12细胞的AR的表达显著上调，同时引起PPARα／δ转录活性下降和ERK1／2及PPARα的磷酸化程度显著增加。用AR siRNA抑制AR表达后，25 mM葡萄糖浓度处理下的AML12中PPARα的磷酸化程度显著降低。 我们采用腹腔注射链脲佐菌素(streptozotoxin，STZ)在C57BL／6小鼠中诱导Ⅰ型糖尿病。在STZ—糖尿病小鼠中，AR抑制剂处理或敲除AR基因，导致肝组织ERK1／2和PPARα的去磷酸化，而且AR抑制剂处理使ACO的mRNA水平显著上升(44％，P＜0.01)，载脂蛋白ApoC3的mRNA水平显著下降(34.8％，P＜0.01)。与此同时，血甘油三酯(TG)和游离脂肪酸水平也显著下降。另一方面，在Ⅱ型糖尿病小鼠模型db／db小鼠中，AR抑制剂的处理也导致肝组织ERK1／2和PPARα显著的去磷酸化，同时伴随着ACO和载脂蛋白ApoA5的mRNA水平的显著上升(ACO上升92％，P＜0.05；ApoA5上升73％，P＜0.05)。与此相对应，肝TG和血TG水平显著下降，同时肝组织的油红染色结果也说明了AR抑制剂处理显著降低了db／db小鼠肝脏中性脂肪含量。 综上所述，AR在肝脏中可对PPARα的磷酸化及转录活性进行调控，进而影响动物体脂质代谢。AR对PPARα的调控作用在很大程度上是由ERK1／2信号转导通路介导的。
慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B,CHB)是一种严重危害人类健康的病毒性传染病。我国是乙肝病毒(Hepatitis B Virus,HBV)高流行区,一般人群的乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface Antigen,HBsAg)阳性率为9.09%,约有1.1～1.2亿为HBV携带者,其中部分有不同程度的肝细胞受损,并可能发展成肝硬化和肝癌。 干扰素(Interferon,IFN)是细胞和机体受到病毒感染,或者受核酸、细菌内毒素和促细胞分裂素等作用后,由淋巴细胞分泌的一种细胞因子,可分为α、β、γ三类。IFN-α具有抗病毒及免疫调节的双重作用,是临床常用的抗HBV药物。 目前用于临床的普通IFN-α半衰期只有4～6h,患者不得不接受频繁的皮下注射(疗程至少半年),但其长期疗效并不确切。重组人白蛋白融合干扰素α-2b融合蛋白( recombinant human serum albumin-interferon-α-2b

fusion protein ,rHSA-IFNα-2b)是运用基因重组技术开发出来的一种新型长效干扰素,其在体内的半衰期显著长于IFNα-2b和聚乙二醇干扰素(Pegylated Interferon,PEG-IFN)。rHSA-IFNα-2b注射频率可以从IFNα-2b的每天一次或每周3次减少到每两周一次,这将极大地方便患者。同时长效干扰素所提供的较为稳定的血药浓度也将提高疗效,降低不良反应。 动物实验及临床试验研究已证明rHSA-IFNα-2b可发挥有效的抗丙肝病毒(Hepatitis

C Virus,HCV)作用,但是否同样具有抗HBV作用还有待进一步研究。本研究拟通过探索rHSA-IFNα-2b对体外2.2.15细胞(HepG2 AZD2281供应商 更多 2.2.15 cell)HBsAg、HBeAg(Hepatitis B e Antigen)分泌、HBV DNA复制的影响,及对鸭乙型肝炎动物模型的肝功能影响和对鸭乙肝病毒(DHBV)DNA的抑制作用,来系统考察rHSA-IFNα-2b的抗HBV作用,为rHSA-IFNα-2b治疗CHB的临床试验提供依据。 IFN-α主要通过激动特异性细胞膜受体来发挥抗病毒作用。当IFN-α与靶细胞表面的特异性受体结合后,通过JAK-STAT信号通路,触发细胞内一系列酶活化,产生一组抗病毒蛋白,包括2′-5′-寡腺苷酸合成酶(2′-5′-oligoadenylate synthetase,2′-5′-OAS)、磷酸二脂酶(phosphodiesterase,PDE)及蛋白激酶(protein Kinase,PK)。OAS可催化2′-5′-寡核苷酸(2′-5′-oligoadenylate,2-5A)合成,激活内源性核酸内切酶,抑制病毒mRNA信息的传递,从而阻止病毒在宿主细胞内繁殖。本研究同时拟通过考察rHSA-IFNα-2b对抗病毒蛋白OAS的影响,及与Jak-Stat通路、p38-MAPK通路的关联,来阐述其发挥抗HBV作用的机制。 (一)体外药效学及机制研究: 本课题选用2.2.15细胞作乙型肝炎体外模型,首先采用MTT法考察rHSA-IFNα-2b对2.2.15细胞的毒性作用。选择含8个实验浓度梯度rHSA-IFNα-2b(500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、3.9nmol/L)的培养液,培养2.2.15细胞9天后,加入含有400mg/L MTT的培养液孵育4 h,弃MTT液并加入DMSO,用酶标仪测定吸光度(absorbance,A)值,来考察药物对细胞的破坏程度。结果发现,rHSA-IFNα-2b对2.2.15细胞形态仅有轻微的损坏,且细胞破坏率与细胞形态变化无明显关系,TC50>500 nmol/L,远高于其有效剂量。 我们选用含三个不同rHSA-IFNα-2b浓度梯度(0.075,0.3,1.2 nmol/L)的培养液来培养2.2.15细胞,每3天更换含有药物的培养液,分别收集第3、6、9天上清液。细胞上清液中的HBsAg、HBeAg采用ELISA法检测,用酶标仪测定其A值,并根据标准品A值折算得出样品浓度。细胞上清液中的HBV DNA浓度通过实时荧光定量PCR测定,最后通过标准品的CT值来计算样品DNA的浓度。实验结果发现,rHSA-IFNα-2b明显抑制HBsAg、HBeAg分泌,其中浓度在0.075～1.2 nmol/L范围内时,其对HBsAg的抑制作用呈现浓度依赖性;rHSA-IFNα-2b能抑制培养上清液中HBV DNA复制,也呈明显浓度依赖性。IFNα-2b与rHSA-IFNα-2b作用无显著性差异。 随后,我们用rHSA-IFNα-2b(0.075、0.3、1.2 nmol/L)作用2.2.15细胞3天后,收集细胞并提取总RNA,用RT-PCR方法考察STAT1、ISGF3、2′-5′-OAS的变化;给予JAK抑制剂或p38抑制剂之后1h再给予rHSA-IFNα-2b(0.