1%戊巴比妥钠腹腔麻醉,迅速断头处死,在低温修块台上分离出双侧海马组织,置于Eppendorf管中,-80℃保存。 4.大鼠海马CA1神经元病理形态学观察 HE染色,光镜下观察海马CA1区神经元形态改变。 5.谷氨酸受体免疫组化染色 按照说明书的操作顺序进行SP法免疫组化染色,镜下观察各组海马CA1区NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1的阳性神经元数目(面密度Sv值对二者的变化进行定量)。 6. Western-Blot检测海马组织谷氨酸受体蛋白的表达水平

称取海马组织,提取总蛋白,BCA法进行蛋白浓度定量。应用Western-Blot方法检测各组大鼠海马组织NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1的蛋白表达水平。 7.实时荧光定量PCR检测海马组织谷氨酸受体mRNA的表达水平 冰上迅速分离大鼠海马,Trizol提取海马总RNA,逆转录cDNA,采用PrimerScriptTM实时荧光定量PCR试剂盒一步法检测各组海马组织中NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1 mRNA的表达水平。 结果 1.水迷宫试验 (1)术前各组大鼠平均逃避潜伏期和跨越平台次数组间差异无显著性(P>0.05);(2)术后第25d～30d,与假手术组比较,VD模型组平均逃避潜伏期明显延长和跨越平台次数显著减少(P0.05)。以上结果提示VD模型大鼠的学习和记忆成绩降低,补阳还五汤可以提高其学习和记忆成绩。 2.光镜下观察大鼠海马CA1区神经元病理学特征 (1)假手术组大鼠海马CA1区锥体细胞核大而圆,核仁明显,细胞排列致密整齐;(2)相比之下,VD模型组大鼠海马CA1区锥体细胞松散,层次不清,有细胞缺失现象,炎性细胞浸润,部分细胞旁有空染区,核固缩、胞质浓染、胞体变小,并且有胶质细胞增生形成结节;(3)补阳还五汤治疗组和尼莫地平组大鼠海马CA1区锥体细胞排列尚整齐,未发现炎性细胞浸润,核固缩现象较少见。

而且 3.谷氨酸受体免疫组化染色 (1)与假手术组海马CA1区NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1阳性神经元面密度值比较,VD模型组明显减少(P<0.05);(2)与VD模型组比较,补阳还五汤治疗组和尼莫地平组大鼠海马CA1区NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1阳性神经元面密度值明显增多(P0.05)。此结果提示VD大鼠海马CA1区NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1水平降低参与了VD的发病机制,补阳还五汤可以促进VD大鼠海马CA1区NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1的表达水平而提高其学习和记忆成绩。 4. Western-Blot检测海马组织谷氨酸受体蛋白的表达水平 SGC-CBP30分子量 (1)与假手术组大鼠海马组织NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1蛋白表达水平比较,VD模型组受体蛋白表达水平显著降低(P<0.05);(2)与VD模型组比较,补阳还五汤治疗组和尼莫地平组大鼠海马组织NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1蛋白表达水平显著升高(P0.05)。此可以提示VD大鼠海马组织NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1蛋白表达水平的降低参与了VD的发病机制,补阳还五汤可以促进VD大鼠海马神经元NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1蛋白的表达水平而提高其学习和记忆成绩。 5.实时荧光定量PCR检测海马组织谷氨酸受体mRNA的表达水平 (1)与假手术组NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1目的基因表达量比较,VD模型组受体目的基因表达量明显降低(P<0.05);(2)与VD模型组比较,补阳还五汤治疗组和尼莫地平组NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1目的基因表达量明显升高(P0.05);(4)各组单位看家基因(β-actin)中NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1的表达量也存在相同差异。此可以提示VD大鼠海马组织NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1

selleck化学药品液面控制 mRNA表达水平的降低参与了VD的发病机制,补阳还五汤可以促进VD大鼠海马神经元NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1 mRNA的表达水平而提高其学习和记忆成绩。 结论 1.本实验建立的VD大鼠模型可模拟人类VD以学习和记忆能力缺损为主的认知功能障碍,是研究VD比较理想的动物模型,对深入研究VD是可行的。VD模型大鼠海马CA1区出现病理性变化。 2. VD大鼠海马NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B蛋白及mRNA表达水平降低,与其学习和记忆成绩下降相一致。提示NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B表达水平降低可能参与了VD的发病。 3. VD大鼠海马AMPA-GluR1蛋白及mRNA表达水平降低,与其学习和记忆成绩下降相一致。提示AMPA-GluR1表达水平降低可能参与了VD的发病。 4.补阳还五汤通过上调VD大鼠海马组织NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、AMPA-GluR1蛋白及其mRNA表达水平,改善海马组织CA1病理变化,减轻脑缺血再灌注对海马神经元的损伤,从而发挥对VD的治疗作用,提高VD大鼠的学习和记忆能力。提示该药可能具有改善VD的药理学作用。
目的 观察姜黄素治疗实验性肝纤维化大鼠的作用效果,并探讨其抗肝纤维化的作用机制。 方法 以四氯化碳腹腔注射方法制作大鼠肝纤维化模型,姜黄素为阳性对照,生理盐水注射组为正常对照组。检测血清ALT、AST、HA、LN、PC-Ⅲ和CⅣ的表达水平;肝组织行HE染色,并进行评分;免疫组化染色观察肝组织I、Ⅲ型胶原、TGF-β1、P38MAPK及P-P38MAPK变化。 结果 较之模型组,姜黄素可明显降低实验性肝纤维化大鼠血清的ALT、AST、HA、LN、PC-Ⅲ和CⅣ的表达水平(P<0.05),明显改善肝脏的病理学情况,肝纤维化评分明显降低(P<0.

In this review, we describe some KRX-0401供应商 of the critical signaling pathways mediating BM niche-LSC interaction,

including SDF1/CXCL12, Wnt/β-catenin, VCAM/VLA-4/NF-κB, CD44, and hypoxia as a newly-recognized physical determinant of resistance, and outline therapeutic strategies for overcoming these resistance factors.
【目的】探讨PI3K抑制剂BKM120体外对结外鼻型NK/TL细胞淋巴瘤(ENKTL)的疗效。【方法】BKM120处理ENKTL细胞SNK6和SNT8后,CCK8试剂盒检测细胞增殖,PI单染色法检测细胞周期,Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡,Western Blotting检测p-PI3K、AKT、p-AKT以及细胞周期相关蛋白的表达情况。BKM120分别与依维莫司、阿霉素和吉西他滨联合处理SNK6和SNT8细胞,金正均”Q”值法分析联合作用效应。【结果】BKM120能够有效抑制SNK6、SNT8细胞的增殖,其IC50值分别为(0.23±0.013)μmol/L和(0.17±0.011)μmol/L。BKM120能使SNK6、SNT8细胞阻滞于G1期,1.0μmol/L的BKM120使SNK6、SNT8细胞G1期比例较对照组分别增加(12.53±1.31)%(P=0.013)和(30.15±2.79)%(P=0.001)。0.5μmol/L和1.0μmol/L的BKM120处理后,SNK6和SNT8细胞均无明显凋亡。此外,BKM120能够降低SNK6、SNT8细胞的p-PI3K、AKT、p-AKT和Cyclin D1的表达。BKM120分别与依维莫司、阿霉素和吉西他滨联合处理SNK6和SNT8细胞,Q值处于0.85至1.15之间,BKM120与mTOR抑制剂、化疗药物联合应用时具有相加作用。【结论】BKM120能够有效抑制ENKTL细胞SNK6和SNT8的增殖,该抑制效应的机制之一是将细胞周期阻滞于G1期。BKM120分别与依维莫司、阿霉素和吉西他滨联合应用,具有相加作用。
目的:观察卡培他滨联合曲妥珠单抗治疗Her-2阳性老年转移性乳腺癌的疗效与安全性。方法:32例老年乳腺癌患者(≥65岁)均经病理组织学证实为复发或转移,Her-2阳性,给予卡培他滨1250 mg/m2口服,2次/d,第1~14天;曲妥珠单抗首次负荷剂量8 mg/kg,后续6 mg/kg静点,21 d为一周期,每2周期评价疗效。结果:32例患者均可评价,其中完全缓解(CR)2例(6.2%),部分缓解(PR)10例(31.3%),稳定≥6个月(SD)11例(34.4%),进展(PD)9例(28.1%),总有效率为37.5%(12/32),临床获益率(CR+PR+SD)为71.9%(23/32);中位疾病进展时间(TTP)8.5个月;主要的毒副反应为手足综合征、腹泻、口腔炎,均可耐受;1例患者出现症状性心力衰竭,停药后改善;无化疗相关死亡。结论:卡培他滨联合曲妥珠单抗治疗Her-2阳性老年转移性乳腺癌疗效确切,毒副反应轻,耐受性良好,是一种安全有效的姑息治疗方案。
目的探索Erbin表达缺失导致Her2阳性的人乳腺癌细胞MDA-453对曲妥珠单抗敏感性的影响。方法设计、构建含人Erbin基因特异性的短发夹RNA(shRNA)及对照shRNA的干扰载体,转染MDA-453人乳腺癌细胞。经G418加压筛选,获得稳定敲低Erbin的MDA-453细胞(MDA-453-Erbin

Selleck Inhibitor Library 一般 sh)和稳定表达对照shRNA的MDA-453细胞(MDA-453-NC),以后者作为对照细胞。应用Western印迹法检测MDA-453-NC和MDA-453-Erbin

sh细胞中Erbin表达水平。分别通过细胞增殖活性实验及细胞集落形成实验,观察敲低Erbin的MDA-453细胞对曲妥珠单抗敏感性的变化。通过免疫组化染色法,分析Erbin在人乳腺癌及正常乳腺组织中的表达。结果建立了稳定敲低Erbin的MDA-453细胞株,发现敲低Erbin表达可诱导MDA-453细胞对曲妥珠单抗产生抗性。与正常乳腺上皮组织相比,人乳腺癌组织标本中Erbin表达水平降低。结论 Erbin表达缺失可能影响乳腺癌对曲妥珠单抗治疗的敏感性。
结直肠癌是较常见的恶性肿瘤,发病率在我国呈逐年上升趋势。肿瘤的发生是多因素、多阶段、多基因改变的结果,包括原癌基因的激活与抑癌基因的失活。PIK3CA基因是近年发现的除KRAS突变之外的结直肠癌常见的突变基因,PI3K下游信号通路的异常活化在结直肠癌的发生过程中发挥着重要的作用。本文就PIK3CA基因的生物学作用,参与肿瘤不同阶段的发展,以及PIK3CA作为肿瘤标志物和分子靶点的潜在临床价值简要作一综述。
子宫内膜癌是常见的女性恶性生殖道肿瘤,其晚期或复发患者的预后仍然较差。近些年新出现的靶向治疗已成为晚期或复发子宫内膜癌的重要治疗手段。PI3K/Akt/mTOR信号通路在子宫内膜癌的发生发展过程中起着重要的调节作用,抑制该通路有效位点的靶向治疗可能提高晚期或复发子宫内膜癌的治疗效果。但目前针对该信号通路的药物研究仍处于初步阶段,仍需要更多的临床试验加以明确疗效。
罗氏公司的最新抗癌药物Trastuzumab-DM1(T-DM1)已经在2013年上半年被美国FDA批准上市,商标名为Kadcyla,主要用于治疗HER2受体阳性的乳腺癌转移和晚期病人,该药物已经进行了多起I期和II期和III期临床试验,凭借着良好的实验数据,最终获得了FDA的上市批准。本文对T-DM(商品名Kadcyla)的开发过程,结构特性,以及已有报道的临床前及临床研究的数据做一综述。
The estrogen receptor(ER) pathway plays a critical role in breast cancer development and progression. Endocrine therapy targeting estrogen action is the most important systemic therapy for ER positive breast cancer. However its efficacy is limited by intrinsic and acquired resistance.

s2(GenBank登记号)含有明确的polyA序列,提示TIRAP-AS是细胞中经过转录后加工的成熟RNA分子,并非基因组非特异性转录活动的产物。TIRAP蛋白在细胞中主要是参与MyD88依赖的信号转导途径,当特异性激活TLR2或TLR4时,TIRAP首先移位至细胞膜并通过其氨基端的磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol Akt抑制剂 4,5-biphosphate, PIP2)结构域与PIP2结合,然后再通过保守的TIR(Toll/interleukin

1 receptor domain-containing)结构域与MyD88蛋白结合并将其募集至TLR受体,继而激活下游的MAPK蛋白激酶与转录因子NF-κB,诱导促炎细胞因子如TNF-a与IL-1等的表达。可见,TIRAP在MyD88依赖的信号通路的激活中具有不可替代的作用。综上所述,作为参与TLR受体信号传导通路的重要分子,TIRAP蛋白在细胞中的功能改变将直接导致机体的先天性免疫反应异常。但目前对TIRAP基因的表达调控机制还知之甚少,其天然反义RNA分子(TIRAP-AS)是否在细胞内调控TIRAP基因的表达?其具体的调控机制及其生物学意义是什么?对这些问题的深入研究将有助于揭示TIRAP基因在细胞中的表达调控机制,促进我们对TIRAP在先天性免疫反应中功能的进一步认识。针对上述科学问题,我们以已知的TIRAP-AS EST序列为基础,通过cDNA末端快速克隆(rapid amplification of cDNA ends,RACE) PCR技术从来源于小鼠的单核巨噬细胞RAW264.7中克隆获得TIRAP-AS的全长cDNA序列。我们克隆的TIRAP-AS基因cDNA存在十种不同形式的拼接体,其长度在1000nt至1200nt之间,与TIRAP Tipifarnib细胞系 mRNA的重叠配对区(overlapping region)长度为447个核苷酸(nucleotide,nt).生物信息学分析显示这些TIRAP-AS分子缺乏明显的开放性阅读框,极有可能是非编码RNA分子。此外,TIRAP-AS基因内含子的剪切位置完全符合经典的GT-AG拼接(splicing)规则,存在典型的poly A加尾信号,而且我们克隆获得的TIRAP-AS cDNA序列3’末端含有polyA序列,表明TIRAP-AS在细胞中需要经过复杂的转录后加工。在获得TIRAP-AS RNA10种选择性拼接体序列的基础上,我们设计了可特异性区分它们的引物,以来源于RAW264.7细胞cDNA为模板,以含有TIRAP-AS选择性拼接体的质粒为阳性对照,进行PCR扩增,结果显示选择性拼接体1A、1B、1D与1E相对表达水平较高,是其在RAW264.7细胞中表达的主要形式。在此基础上,我们分别以含有TIRAP与TIRAP-AS

cDNA的质粒为标准参照,采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术分析了TIRAP mRNA与TIRAP-ASRNA分子在RAW264.7细胞中的相对表达水平,结果表明TIRAP mRNA的表达水平大约是TIRAP-AS RNA的8倍。此外,我们还采用了定量PCR分析了TIRAP mRNA与TIRAP-AS RNA在小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、皮肤等8种不同的组织中的相对表达水平,以P-actin为内参照,结果显示TIRAP mRNA在不同组织中的表达水平由高到低依次为：肝>肌肉>心脏>肾>肺>脾>皮肤>脑,而TIRAP-AS

RNA分子在不同组织中的表达水平则为：肝>肌肉>心脏>肺>脑>皮肤>肾>脾。同时,我们还采用Western蛋白印迹分析了TIRAP蛋白质在不同组织中的表达水平,若以心脏为对照组,则它在脑组织中的表达相对较高,在脾、肺、肌肉等组织中的表达相当,在肝和皮肤组织中的表达相对较低,在肾组织中几乎不表达。由于TIRAP蛋白主要参与TLR2与TLR4激活后的下游信号转导,我们首先采用100ng/ml LPS (TLR4特异性激动剂)和100ng/ml Pam2CSK4(TLR2特异性激动剂)刺激RAW264.7细胞和,于不同时间点(Omin、30min、60min、 120min、240min、480min)收集细胞,采用实时荧光定量PCR技术检测TIRAP Veliparib mRNA和TIRAP-AS RNA表达水平的变化,同时采用Western蛋白印迹技术检测TIRAP蛋白表达水平。结果显示：激活TLR2或TLR4受体可诱导RAW264.7细胞TIRAP mRNA和TIRAP-AS RNA水平均呈现出类似的时间依赖性改变；而且LPS刺激可诱导RAW264.7细胞中TIRAP蛋白呈现时间依赖性的下降。此外,采用100ng/ml LPS刺激C57BL/6小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow derived macrophage,BMM)诱导TIRAP mRNA和TIRAP-AS RNA表达水平的变化趋势与RAW264.7基本一致。为了进一步分析其他类型的TLR受体激活对TIRAP mRNA与TIRAP-ASRNA表达水平的影响,我们分别采用小鼠TLR1-9不同激动剂刺激RAW264.7细胞1h,回收细胞并采用实时荧光定量PCR分析TIRAP mRNA和TIRAP-ASRNA的表达水平的变化,结果显示100 ng/ml Pam3CSK4(TLR1/2特异性激动剂)与5μM ODN1826(TLR9特异性激动剂)同样可以诱导RAW264.

2神经再生的检测 将各组的小鼠进行灌流取脑后,冠状切片进行BrdU染色,统计新生细胞的数目。 2.3学习记忆模型 我们采用海马相关的环境依赖性的条件恐惧模型和水迷宫模型,来分别评价小鼠的恐惧记忆和空间记忆。 3. APP/PS1转基因小鼠模型 采用APP/PS1双敲入转基因小鼠模型来模拟人阿尔兹海默病,进行实验评价。该小鼠在五个月之后脑内即可产生大量Aβ富集的老年斑,出现与人阿尔兹海默病类似的生理现象。 实验结果 1.丰富环境刺激后小鼠海马ILK蛋白表达明显升高 我们在给予小鼠丰富环境刺激之后连续四周取小鼠海马脑区检测,发现从第二周开始小鼠海马脑区的ILK蛋白和mRNA水平开始升高,三四周达到最高值并一直维持。 2. ILK参与丰富环境引起的神经再生和学习记忆的增强 2.1ILK参与丰富环境提高的学习记忆 丰富环境刺激一个月后,小鼠进行空间记忆和环境条件恐惧记忆检测,发现小鼠Morris水迷宫训练阶段找到水下平台的潜伏时间显著减少,测试阶段在平台所在象限的逗留时间则显著增加,说明其空间记忆增强。同时,经过丰富环境刺激后的小鼠在contextual

buy Antiinfection Compound Library fear conditioning测试阶段的freezing时间显著提高,说明丰富环境能增强环境条件恐惧记忆。但降低ILK表达之后,丰富环境刺激引起的学习记忆增强则被抑制。 2.2ILK参与丰富环境提高的神经再生 丰富环境刺激一个月后,小鼠海马齿状回部位的BrdU阳性细胞数目及BrdU和NeuN双阳性细胞数目显著增加,说明丰富环境刺激引起小鼠齿状回统计再生的增殖与存活过程增强。当我们降低齿状回部位ILK的表达之后,检测发现BrdU阳性细胞数目及BrdU和NeuN双阳性细胞数目均下降,说明给予丰富环境刺激引起的神经再生增殖和存活能力的增强被抑制。。 3. ILK参与丰富环境引起的神经再生和学习记忆增强的机制。 3.1丰富环境过程中GSK3β活性的变化 丰富环境刺激四周之后,ILK的下游分子糖原合成激酶3β (GSK3β)9位点丝氨酸的磷酸化水平升高。而在ILK被损伤的小鼠中,其GSK3β9位点丝氨酸的磷酸化水平则相应降低。ILK降低之后,给予丰富环境刺激的小鼠其GSK3β9位点丝氨酸的磷酸化水平依旧比正常小鼠要低。 3.2GSK3β的抑制剂SB216763能够逆转ILK降低导致的神经再生和学习记忆损伤

我们给予腹腔注射SB216763连续两周,检测Morris水迷宫和contextual fear conditioning之后发现,原本降低ILK之后导致水迷宫训练阶段潜伏期延长、测试阶段在平台象限逗留时间降低以及contextual fear conditioning测试的freezing时间减少,而给予SB216763之后能够逆转这种损伤。我们检测海马齿状回部位神经再生,统计发现降低ILK后损伤后BrdU阳性细胞以及BrdU和NeuN双阳性细胞数目显著降低,而给予SB216763后能够逆转这种损伤。 4.增强ILK能够缓解APP/PS1转基因小鼠的记忆缺陷 4.1在APP/PS1转基因小鼠中ILK的改变及学习记忆缺陷 我们检测发现,在APP/PS1转基因小鼠中,ILK的表达明显下降,通过检测发现,转基因小鼠齿状回部位BrdU和NeuN双阳性细胞数目减少,说明APP/PS1小鼠的神经再生存活受损。我们通过Morris水迷宫检测发现转基因小鼠的水迷宫训练阶段潜伏期延长,测试阶段在象限内时间较少。在contextual

fear conditioning模型检测发现转基因小鼠的freezing时间降低,说明其记忆能力受损。 4.2增强ILK可以缓解APP/PS1转基因小鼠的神经再生和记忆损伤 没有 我们采用过表达病毒在小鼠海马脑区增强ILK之后,检测发现增强ILK之后BrdU和NeuN双阳性细胞数目显著增强,说明原本受损伤的神经再生得到了缓解。通过Morris水迷宫检测发现,增强ILK后降低了转基因小鼠的潜伏时间、延长了小鼠在平台象限内的逗留时间；检测contextual fear conditioning发现,增强ILK延长了测试阶段转基因小鼠的freezing时间。 4.3盐酸氟西汀对APP/PS1转基因小鼠的作用 一般 我们给予APP/PS1转基因小鼠连续注射氟西汀四周,检测发现氟西汀使得转基因小鼠BrdU和NeuN双阳性细胞数目显著增强,说明原本受损伤的神经再生得到了缓解。通过Morris水迷宫检测发现,给予氟西汀之后降低了转基因小鼠的潜伏时间、延长了小鼠在平台象限内的逗留时间；检测contextual fear conditioning发现,给予氟西汀延长了测试阶段转基因小鼠的freezing时间。 实验结论 1. ILK在丰富环境过程中表达增加,并且干预ILK之后原本丰富环境增强的神经再生学习记忆都受到损伤,说明其参与丰富环境对学习记忆能力增强的过程. 2. ILK在丰富环境中发挥作用依赖于下游分子GSK3β的作用。给予GSK3β的抑制剂SB216763能够纠正ILK干预引起的神经再生和学习记忆的损伤。 3.增强ILK能够缓解APP/PS1转基因小鼠的神经再生和学习记忆损伤,说明ILK可能与阿尔兹海默病十分相关。我们给予能够刺激神经再生的抗抑郁药盐酸氟西汀同样也能缓解APP/PS1转基因小鼠的记忆损伤,这给临床治疗阿尔兹海默病提供了新的思路。 创新性 1.发现了ILK能够通过影响海马齿状回的神经再生而参与丰富环境增强记忆的行为过程。 2. ILK对丰富环境过程中神经再生和学习记忆的影响依赖于它的下游分子GSK3β。 3.发现增强ILK能够缓APP/PS1转基因小鼠的神经再生和学习记忆的损伤。
神经胶质瘤是中枢神经系统原发肿瘤中最常见的一种类型,约占成人颅内肿瘤的40%。在过去的20多年里，胶质瘤的诊疗有了很大的提高，然而其疗效并没有显著地改善。尽管目前神经胶质瘤的发病机理还不十分明确，但大量研究表明电离辐射和遗传变异是两个主要的危险因素。电离辐射暴露极易造成各种形式的DNA损伤，包括DNA单、双链断裂（DSBs）。单核苷酸多态性（SNPs）作为人类基因组中最丰富的序列变异形式造成了人类的表型差异和对疾病易感性的差异。目前，运用高通量基因分型芯片技术的GWAS研究已发现大量的多态性位点与胶质瘤的发病相关，这些位点位于5p15.33（TERT），8q24.21（CCDC26），9p21.3（CDKN2A-CDKN2B），20q13.33（RTEL1），11q23.3（PHLDB1），以及7p11.

05)；雷帕霉素使细胞周期阻滞在G1期,17-AAG亦使细胞周期阻滞在G1期,尤其是作用48h时周期阻滞明显(P<0.0001)；单用雷帕霉素或17-AAG时均可降低蛋白AKT的表达并在一定程度上诱导细胞凋亡(P<0.0001)；联合使用雷帕霉素与17-AAG时可显著降解AKT,明显诱导细胞凋亡,凋亡率明显高于任一单药(P
目的 海绵来源化合物BA是一个具有全新化学骨架结构的抗肿瘤先导化合物,但是其体内外抗肝癌生物学效应及作用机制尚不明确。本研究以人肝癌细胞和裸鼠肝癌移植瘤模型为研究对象,分析海绵来源化合物BA抑制细胞增殖、迁移、诱导细胞凋亡及其作用机制,并探讨BA在裸鼠肝癌模型中的抗肝癌效应及其作用机制。 还有 方法 1、体外研究：①BA抑制细胞增殖的效应：MTT比色法检测BA对人肝癌细胞SMMC-7721、Huh-7和HepG2,正常肝细胞L02增殖的影响；②BA抑制细胞迁移的效应：Transwell法检测BA对SMMC-7721细胞的迁移能力；③BA诱导细胞凋亡的效应：H&E染色法鉴定BA诱导SMMC-7721细胞凋亡形态的变化,荧光倒置显微镜与流式细胞术Annexin

V-FITC/PI法分析BA诱导SMMC-7721细胞凋亡作用；Western Blot法检测凋亡蛋白Caspase3和Caspase9的表达变化；④BA抑制细胞增殖、迁移并诱导凋亡的作用机制：Western Blot法检测BA及BA联用LY294002或IGF-1对SMMC-7721细胞中PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达变化。 2、体内研究：①裸鼠肝癌模型的建立：采用1.0×108/m1肝癌SMMC-7721细胞悬液,于裸鼠右腋皮下接种0.1ml,建立肝癌裸鼠模型；②药物干预：裸鼠肿瘤生长至100-150mm3左右,将裸鼠分为4组,以空白溶媒组、5mg/kg和10mg/kg化合物BA组以及10mg/kg5-FU组连续5天腹腔注射给药；③检测指标：监测裸鼠肿瘤大小,计算抑瘤率,评价化合物BA体内抑制肝癌效应；记录裸鼠的体重,研究BA对裸鼠生存质量的影响；眼球取血检测裸鼠肝肾功能；取肿瘤组织以及裸鼠各脏器组织,H&E染色观察肝癌和脏器组织形态变化；④BA体内抗肝癌的作用机制：采用免疫组化和Western

查找更多 Blot法分析BA对肿瘤组织中PI3K/Akt信号通路相关蛋白的影响。 结果 1、化合物BA的体外抗肝癌效应 ①BA抑制细胞增殖的效应：BA能够抑制系列肝癌细胞株与正常肝细胞L02的增殖,且抑制SMMC-7721细胞增殖呈浓度与时间依赖性关系(p<0.05)。②BA抑制细胞迁移的效应：经BA处理的SMMC-7721细胞的迁移数低于未经BA处理的SMMC-7721细胞组(P<0.05)；呈浓度依赖性关系下调凋亡蛋白Caspase9表达水平(p0.05)；BA联合LY294002或IGF-1对PI3K/AKT信号通路中蛋白表达的作用：在SMMC-7721细胞中,BA联合LY294002组与单用BA和LY294002组相比,PI3K、p-Akt(Ser473)蛋白的表达下降更显著(p<0.05)；BA联合IGF-1组与单用IGF-1组相比,PI3K、p-Akt(Ser473)蛋白的表达下降(p
研究目的：探索PcG 而且 (Polycomb Group)家族蛋白的成员之一色素框同源蛋白7(Chromobox Protein Homolog7,CBX7)对胃癌干细胞自我更新能力、克隆增殖能力等干细胞相关特性的调节作用,并探索CBX7调控胃癌干细胞样特性的作用机制。 研究方法：采用无血清悬浮培养的方法从胃癌细胞系中分离出胃癌干细胞样亚群,Western blot检测胃癌干细胞样亚群与贴壁细胞比较干细胞相关因子Oct4.

CD44. CD24及PcG家族蛋白CBX7表达的差异。基因转染下调胃癌细胞中CBX7表达,荧光显微镜下观察转染效率,Western blot检测基因下调效果,无血清悬浮培养、平板克隆等检测CBX7表达下调后胃癌干细胞样特性的变化。Western blot检测CBX7下调后下游已知靶基因p16、E-cadherin和可能靶基因pAkt、pERK表达变化,RT-PCR检测CBX7下调后miR-21表达改变。同时Western blot检测胃癌悬浮干细胞球与贴壁细胞比较CBX7下游已知靶基因p16及可能靶基因pERK, pAkt表达的差异,RT-PCR检测miR-21表达的差异。在胃癌细胞中下调p16表达,观察胃癌干细胞样特性的变化。采用共转染的方法,在胃癌细胞中同时干扰CBX7和p16表达,观察胃癌干细胞样特性的变化。 主要结果： 1.MKN28. SGC-7901、NCI-N87胃癌细胞系能在无血清悬浮培养条件下产生干细胞球,而MKN45、HGC-27胃癌细胞系在无血清悬浮培养条件下不能形成干细胞球。MKN28、SGC-7901胃癌悬浮干细胞球较贴壁细胞明显高表达CBX7和干细胞相关因子Oct4, MKN28胃癌悬浮干细胞球高表达干细胞表面标志分子CD24,不表达CD44,而SGC-7901胃癌悬浮干细胞球高表达干细胞表面标志分子CD44, CD24表达无明显差异。 2.基因转染下调胃癌细胞CBX7表达后,胃癌细胞悬浮培养成球率下降,克隆形成率降低。 3.基因转染下调胃癌细胞CBX7表达后,SGC-7901细胞中p16、E-cadherin表达上升,且pAkt、pERK表达下降,Akt、ERK表达无明显改变,miR-21则表达下降。MKN28、AGS细胞中pAkt、pERK表达下降,Akt、ERK表达无明显改变。 4. MKN28、SGC-7901胃癌干细胞球与贴壁细胞比较,pAkt表达无明显差异,pERK表达略有下降,SGC-7901胃癌干细胞球低表达p16, western blot未检测到MKN28细胞p16表达,MKN28胃癌干细胞球较贴壁细胞比较miR-21表达无明显变化。 5. ATM/p53在MKN28胃癌干细胞球中表达降低,而在SGC-7901胃癌干细胞球中无明显改变。 6.

关于DLBCL中PI3K/AKT通路的活化机制及DLBCL中PI3K 4个催化亚单位的表达水平目前国内外尚未见相关文献报道。本研究采用实时定量RT-PCR的方法从mRNA水平检测了4个催化亚单位的表达,并初步探讨各个亚单位表达与PI3K/AKT通路活化的关系。 3.本研究成功建立了人DLBCL裸鼠移植瘤模型,为进一步体内研究提供了较理想的动物模型;并利用该模型对DLBCL中PI3K/AKT通路的生物学效应进行了研究。目前国内外尚未见相关研究报道。
第一部分舒脉胶囊对心肌缺血大鼠促血管新生的研究 背景

目前,缺血性心脏病使全世界数百万人经受着病痛的折磨。改善心肌缺血在缺血性心脏病的防治研究中具有重要意义。治疗性血管新生可促进缺血组织周边侧支循环的建立,心脏冠脉侧支循环的形成和开放能改善心肌缺血、坏死,延缓缺血性心肌病的形成,改善患者的临床症状和预后,已成为心血管研究领域的热点之一。冠心病的中西医结合防治研究也已从单纯改善病变血管供血转向同时促进侧支循环的建立。中医药益气化瘀的治疗法则及其临床有效性,为中西医结合促血管新生的研究提供了理论和临床依据。 特异性内皮细胞丝裂原血管内皮生长因子(VEGF)家族在血管新生过程中起关键作用。但是,通过单一促血管生成因子诱导产生的新生血管结构以内皮细胞(EC)为主,没有血管平滑肌细胞(VSMC)和周细胞包被形成完整的动脉中膜结构,因此血管容易出血渗出,亦无法输送血流,最终会导致新生血管退化。而血小板衍生生长因子(PDGF)家族成员尤其是PDGF-BB是作用很强的促动脉生成因子,主要作用于血管壁细胞包括周细胞和VSMC。PDGF-BB与细胞表面的酪氨酸蛋白激酶受体结合,募集周细胞和VSMC包绕新生血管网络形成完整的血管结构从而发挥稳定血管的作用。血管生成(angiogenesis)和动脉生成(arteriogenesis)都有助于心脏的血管新生,但对于改善心肌血流量,动脉生成是最重要的过程。 PI3K/Akt信号通路激活在介导生长因子促血管新生的作用已引起重视。PI3K/Akt通过诱导VEGF的表达达到促血管新生的作用。抑制PI3K/Akt信号通路活性可降低VEGF、PDGF受体VEGFR2及PDGFR活性及其作用底物的磷酸化。 抑制剂 Library high throughput 随着中西医结合的发展,中药在心血管疾病的防治中的作用越来越受到重视。既往研究表明中药单体成分及复方制剂可不同程度的促进VEGF、bFGF等mRNA及蛋白的表达,从而促进血管新生。但中药对信号通路介导促血管新生的分子机制的研究及对促动脉生成因子的研究仍属崭新的研究领域。 舒脉胶囊是导师根据多年的临床经验研制而成,是大量应用于临床治疗缺血性心脏病的中药复方制剂。本研究通过对心肌缺血(Myocardial ischemia,MI)大鼠缺血心肌组织学、形态学改变的观察,通过超声心动图分析左室心功能,通过实时定量RT-PCR技术检测缺血心肌VEGF、PDGF-BB mRNA的表达,以及通过Western blot检测缺血心肌磷酸化PI3K/Akt、VEGF、PDGF-BB的蛋白表达的改变,通过免疫组化检测缺血心肌微血管密度,探讨舒脉胶囊在缺血心肌中促血管新生的作用,并探讨其信号调控机制,为其临床防治缺血性心血管疾病提供更为可靠的科学依据。 更多 目的 1.通过观察舒脉胶囊对实验性大鼠缺血心肌组织学、形态学及心功能改变,及对毛细血管与微动脉的新生的影响,探讨舒脉胶囊促血管新生的疗效。 2.观察舒脉胶囊对大鼠缺血心肌磷酸化PI3K、Akt蛋白表达,及VEGF、PDGF-BB的蛋白及mRNA表达影响,探讨舒脉胶囊促进稳定而有功能的血管新生的信号调控机制。

方法 1.研究对象 建立大鼠心肌缺血实验模型Wistar大鼠结扎左冠状动脉前降支建立心肌缺血模型。造模成功的大鼠随机分为舒脉大剂量/LY294002组(SMCH/LY)、舒脉小剂量组(SMCL)、舒脉大剂量组(SMCH)、贝复济组(bFGF)、模型组(MIR);另设假手术组(Sham)。每组24只,2周、4周每个时间段各12只。 SMCH组灌胃给予舒脉胶囊1.71g/(kg.d)(相当于临床用量的30倍),SMCL组灌胃给予舒脉胶囊342mg/(kg.d)(相当于临床用量的6倍),SMCH/LY组灌胃给予舒脉胶囊1.71g/(kg.d)(相当于临床用量的30倍),腹腔注射给予PI3K抑制剂LY294002(0.3mg/kg,溶解于双蒸水中,每3天给药一次),bFGF组给予贝复剂(bFGF),于开胸结扎冠脉后立即在结扎处周围予bFGF心肌注射1次(125IU),术后始皮下注射肝素1250U/kg,每日1次,连续5天。MIR组和Sham组分别灌胃给予等量蒸馏水。灌胃给药大鼠,均为每日1次,连续给药2周和4周。末次给药后禁食24 h,不禁水。10%水合氯醛,300mg/kg,腹腔注射麻醉后进行后续实验。 2.研究内容 (1)心功能检测;(2)Western

blot检测缺血心肌VEGF、PDGF-BB、PI3K、p-Akt蛋白表达;(3)实时定量RT-PCR(Real-time Quantitative 寻找更多 RT-PCR)检测缺血心肌VEGF、PDGF-BB mRNA表达;(4)检测缺血心肌微血管密度(小静脉:vWF免疫组化染色法,小动脉:αSMA免疫荧光染色法);(5)Masson染色检测缺血心肌胶原含量的变化。 结果 1.心功能检测 治疗第2周后,SMCH、SMCL、bFGF组的左室射血分数(LVEF)较MIR组显著增高(P＜0.05);SMCH与SMCL、bFGF组比较差异无显著性意义(P＞0.05)。SMCH、SMCL、bFGF组左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)较MIR组显著降低(P＜0.05)。应用SMCH+LY294002(SMCH/LY)较MIR组LVEF、LVESD、LVEDD无显著性差别(P＞0.05)。进一步组间两两比较发现,应用大剂量舒脉胶囊组(SMCH)明显高于SMCH/LY组(P＜0.05)以及Sham组(P＜0.05)、MIR组(P＜0.05)。SMCH组较bFGF组或应用小剂量舒脉胶囊组(SMCL)LVEF、LVESD、LVEDD无显著性差异(P＞0.05)。 治疗第4周后,SMCH、SMCL、bFGF组的LVEF较MIR组显著增高(P＜0.05);LVESD、LVEDD较MIR组显著降低(P＜0.05)。但应用SMCH+LY(LY294002)较MIR组LVESD、LVEDD无显著性差异(P＞0.05);但LVEF较MIR组升高。进一步两两比较分析,SMCH组与bFGF组差别无统计学意义,SMCH治疗组较SMCL或SMCH/LY的LVEF、LVEDD显著增高(P＜0.05)。SMCH组较SMCL组LVESD无显著性差别(P＞0.05)。 2.Western blot检测分析 治疗第2周后,SMCH、SMCL、bFGF组VEGF、PDGF-BB、PI3K、p-Akt蛋白表达较MIR组显著升高(P＜0.

7细胞白细胞介素-1(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)转录的影响及其机制的探讨。方法通过实时荧光定量(Real-time)PCR法检测OA作用不同时间RAW264.7细胞和原代枯否细胞IL-1β、TNF-α和IL-6

mRNA的表达;并进一步分析在RAW264.7细胞中加入3种不同信号通路的抑制剂对上述3种炎症因子mRNA表达的影响。OA作用RAW264.7细胞和原代枯否细胞不同时间后,Western blot分析p38 MAPK的磷酸化水平。结果 OA刺激RAW264.7细胞6、12、24 h后,IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA表达明显升高。OA作用于分离的原代枯否细胞3 h和6 h后,也可观察到相同的结果。p38 MAPK特异性抑制剂SB203580可以明显地抑制OA诱导的RAW264.7细胞内IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA的表达,但PKA和NF-κB的抑制剂无此作用。RAW264.7细胞和原代枯否细胞经OA刺激后,p38 MAPK磷酸化水平明显增强。结论 TGR5可能通过活化p38 MAPK磷酸化诱导炎症细胞IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA的表达,提示TGR5在无其他刺激因素作用下,具有诱导炎症因子表达的作用。
目的通过抑制MAPK通路活化,观察其对脓毒症大鼠组织和血清诱导型一氧化氮合成酶(iN-OS)及一氧化氮(NO)合成的影响以及循环变化.方法大鼠脓毒症模型采用经典的盲肠结扎穿孔术(cecalligation

所以 puncture,CLP),将SD大鼠随机分为正常对照组、假手术组、CLP脓毒症组和SB203580治疗组.采集组织和血清并测定组织iNOSmRNA表达水平,NO检测试剂盒(酶法)检测组织和血清NO含量;同时分别监测上述各时间点的脉搏和平均动脉压.结果与正常组大鼠相比,CLP后各时间点脓毒症大鼠肺、血管和血清iNOS mRNA、NO含量均升高明显;而MAP下降明显、脉搏明显升高(P<0.05,P<0.01).治疗组与CLP组相应时间点相比,iNOSmRNA表达在肺和血管多个时间点降低;而肺和血管及血清NO含量下降;血压和脉搏均显著好转(P<0.05,P
Objective To investigate the neuroprotective effects and the mechanism of this protection of raloxifene (RLX), a selective estrogen receptor modulator. Methods MTT assay and flow cytometry with annexin V-FITC/PI staining were performed to evaluate the neuroprotective effects of RLX on Ab25-35 -induced toxicity. The potential selleckchem mechanisms were studied by Western

blotting in cultured rat pheochromocytoma cells (PC12 cells). Results RLX(1 000 nmol/L), in combination with Ab25-35 (30 mmol/L), increased the cell viability SGI-1776体外 (P
目的:研究中药单体柚皮苷(NG)对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞分化过程中MAPK信号通路的影响。方法:观察在正常、加入p38、ERK和JNK通路抑制剂SB203580、PD98059、SP600125及3种抑制剂全部加入的情况下,各组碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)、I型胶原(Col I)等骨向分化指标的差异。用Western blotting技术检测各组p38、ERK1/2和JNK蛋白的磷酸化水平,用荧光定量PCR技术检测细胞因子转化生长因子β1(TGF-β1)、骨形成蛋白2(BMP-2)和核心结合因子α1(Cbfα1)mRNA的表达。结果:(1)10-7mol/L为本实验中NG的最佳促骨向分化浓度。(2)NG最佳浓度组的ALP和BGP含量比其它各组都高(P0.05);与NG组相比,加入不同抑制剂组的ALP、BGP和ColⅠ表达量出现不同程度的降低。(3)与空白组相比,NG组JNK蛋白的磷酸化水平升高(P<0.05),p38蛋白的磷酸化水平降低(P0.05)。与NG组相比,加入不同抑制剂组的p38、ERK1/2和JNK蛋白的磷酸化水平有升高也有降低。(4)NG组上调BMP-2的表达(P<0.05),下调Cbfα1的表达(P0.05)。与NG组相比,加入不同抑制剂组的TGF-β1、BMP-2和Cbfα1 mRNA表达量出现不同程度的降低。结论:NG主要通过激活MAPK信号通路中ERK通路、JNK通路以及上调BMP-2的表达,促进MSCs的骨向分化。NG上调BMP-2的表达受MAPK通路中p38通路的影响较大。
目的研究水通道蛋白9(AQP9)mRNA表达水平、水通道蛋白9及p38蛋白表达及其磷酸化水平对肝癌细胞HepG2和肝正常细胞L-02砷摄入的影响,探讨水通道蛋白9磷酸化的调控机制。方法采用电感藕合等离子体质谱法(ICP-MS)测定细胞内砷含量。采用实时定量PCR、免疫印迹法和免疫共沉淀技术分别检测不同处理后两细胞株中水通道蛋白9 mRNA、水通道蛋白9和p38蛋白表达水平及其磷酸化水平。采用SPSS统计软件分析实验数据。结果 HepG2细胞内砷含量及摄入速度高于L-02细胞。HepG2细胞的水通道蛋白9 mRNA表达水平在6 h内随NaAsO2处理时间延长而显著增加(P<0.

Here we review and summarize the known resistant mechanisms to EGFR-TKIs and provide potential targets for development of new therapeutic strategies.
表皮生长因子受体家族,又称HER/ERBB家族,由四个成员组成:HER1/EGFR/ERBB1、HER2/NEU/ERBB2、HER3/ERBB3和HER4/ERBB4,在肿瘤的发生发展中具有重要作用。以EGFR家族为靶点的治疗已经成为当前的研究热点,尤以HER1、HER2的研究最为深入,相应的靶向治疗药物已应用于临床。但随着时间的推移,EGFR抑制剂耐药现象逐渐出现。目前研究发现,针对HER3的靶向治疗策略可能逆转这种耐药现象。全文综述HER3在肿瘤发生发展中的角色,EGFR抑制剂耐药机制以及HER3抗体逆转EGFR抑制剂耐药的研究进展,以期为优化EGFR家族靶向治疗提供新的思路。
1病历报告患者,女,51岁。因发现左乳腺肿物5个月于2012年8月20日入院,入院后查乳腺彩超示:左乳实性团块7.5cm×7.0cm×5.5cm,左腋下多发低回声结节,最大2.0cm×1.0cm(图1A)。于2012年8月21日行左乳腺肿物及左腋下淋巴结穿刺术,穿刺病理:(左侧)乳腺侵润性导管癌,Ⅱ级,未见脉管内
癌症对人类健康造成严重威胁。肿瘤的发生发展与多种因素密切相关,除了年龄、种族及地理等因素外,临床研究中还发现乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肝癌、前列腺癌及结肠癌等多种肿瘤在男性与女性中的发生率存在显著性差异,认为性激素可能会影响激素靶向性癌症的发生与发展,其中雌激素及其信号通路近年来成为广受关注的热点。雌激素受体(Estrogen

Selleck Doramapimod receptor,ER)包括ERα和ERβ,于1977年首次在子宫内膜细胞中被发现。
磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3 kinase,PI3K)是细胞内重要的信号分子,它具有调节细胞增殖、分化、代谢、凋亡等功能。PI3K的基因易发生突变和扩增,从而导致PI3K被激活,与肿瘤的形成和发展密切相关。IA型的PI3K及其下游的信号分子组成的通路参与调节肿瘤细胞的增殖、存活、黏附、迁移等活动。综述了IA型PI3K——PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kδ与肿瘤发生、发展的关系,列举了20个具有代表性的IA型PI3K抑制剂,并讨论了它们的分子抑制机制。
目的:体外观察白桦脂酸对天然表达缝隙连接蛋白32(Cx32)的BRL-3A细胞的细胞缝隙连接(GJ)功能及Cx32蛋白表达水平的影响.方法:SRB法检测不同质量浓度白桦脂酸对BRL-3A细胞的毒性;细胞接种荧光示踪法观察不同质量浓度白桦脂酸对GJ功能的影响;Western

blot方法检测白桦脂酸影响GJ功能的质量浓度对Cx32蛋白表达水平的影响.结果:白桦脂酸在0~1μg/m L质量浓度对BRL-3A细胞无毒性作用;白桦脂酸(0.01~1μg/m L)质量浓度依赖性地降低GJ功能,但对Cx32表达无影响.结论:白桦脂酸在0.01~1μg/m L质量浓度范围内,降低BRL-3A细胞的GJ功能;这种作用与Cx32蛋白的表达水平无关.
磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)蛋白家族介导的PI3K-Akt-mTOR信号传导通路涉及人体众多细胞功能的调节,是近年来抗肿瘤药物研究的重要靶标。Ⅰ型PI3K具有PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kδ和PI3Kγ4种关键亚型,这4种亚型各自介导不同的生命活动,因此设计亚型选择性抗肿瘤药物能够增加治疗的选择性,减少毒副作用。本文对于近期PI3K关键亚型抑制剂,特别是PI3Kα和PI3Kδ抑制剂,以及它们在PI3K-Akt-mTOR信号传导通路中的作用进行综述。
2015年1月20日奥巴马首次提出”精准医疗计划”,致力于治愈癌症和糖尿病等疾病,意味着精准医学时代的来临。所谓”精准医学”是随着基因组测序技术快速进步以及生物信息与大数据科学的交叉应用而发展起来的新型医疗模式。其本质是通过基因组、蛋白质组等组学技术和医学前沿技术,对于大样本人群与特定疾病类型进行生物标记物的分析与鉴定、验证与应用,从而精确找到疾病的原因和治疗的靶点,并对一种疾病不同状态和过程进行精
Acute

LY2157299 获悉更多 myeloid leukemia(AML) is characterized by the accumulation of circulating immature blasts that exhibit uncontrolled growth, lack the ability to undergo normal differentiation, and have decreased sensitivity to apoptosis. Accumulating evidence shows the bone marrow(BM) niche is critical to the maintenance and retention of hematopoietic stem cells(HSC), including leukemia stem cells(LSC), and an increasing number of studies have demonstrated that crosstalk between LSC and the stromal cells associated with this niche greatly influences leukemia initiation, progression, and response to therapy. Undeniably, stromal cells in the BM niche provide a sanctuary in which LSC can acquire a drug-resistant phenotype and thereby evade chemotherapyinduced death. Yin and Yang, the ancient Chinese philosophical concept, vividly portrays the intricate and dynamic interactions between LSC and the BM niche. In fact, LSC-induced microenvironmental reprogramming contributes significantly to leukemogenesis.

Zey体外抗肿瘤作用研究体外培养人结肠癌细胞HCT-8,人宫颈癌细胞HeLa和Caski,人肝癌细胞HepG2,人乳腺癌细胞MCF-7和MX-1,人口腔表皮样癌细胞KB,人胃癌细胞BGC823,人前列腺癌细胞DU-145和PC-3共10种肿瘤细胞株和人正常前列腺基质永生化细胞WPMY-1和人正常膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1共2种正常细胞株,采用MTT法检测Zey的增殖抑制作用,并计算出半数抑制浓度IC50 (μM)。以对Zey敏感的人宫颈癌HeLa和Caski细胞为研究对象,首先以不同剂量(0、3.27、6.54、13.08、26.16和52.32 μM；0、1.64、3.27、6.54、13.08和26.16μM)的Zey分别于不同时间(12、24、36、72、96 h)处理HeLa和Caski细胞,测定其抑制肿瘤细胞增殖的时效和量效关系。Zey处理细胞24 h后,光学显微镜观察对细胞凋亡形态的影响；DAPI染色观察对细胞核凋亡形态的影响；克隆原形成试验检测对肿瘤细胞集落形成能力的影响；流式细胞术分析对肿瘤细胞周期分布的影响；明胶酶谱法检测对肿瘤细胞基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)分泌的影响。2. SILAC分析Zey对肿瘤细胞蛋白质组表达变化的影响通过体外培养Zey敏感的人宫颈癌HeLa细胞,应用SILAC培养基进行细胞培养、同位素标记,Zey干预24

h后,提蛋白,电泳,进行质谱检测。应用Gene Ontology、 Cytoscape软件和Western blot、qPCR技术分析和鉴定Zey处理前后人宫颈癌HeLa细胞中蛋白质组以及磷酸化蛋白质组表达的变化。3.Zey诱导肿瘤细胞凋亡作用研究应用透射电镜观察Zey对肿瘤细胞超微结构的影响；采用AO/EB染色检测Zey诱导肿瘤细胞凋亡的程度；应用流式细胞术通过JC-1染色检测Zey对肿瘤细胞线粒体膜电位的影响；应用流式细胞术采用Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒检测Zey诱导肿瘤细胞凋亡的时期和比例；采用TUNEL原位检测凋亡法进一步检测Zey对肿瘤细胞诱导凋亡的比例；应用DCFH-DA荧光探针法检测Zey对肿瘤细胞活性氧产生的影响。4.Zey体外抗肿瘤分子机制研究使用Discovery AZD6244 Studio 3.5软件包中ligand profiler模块,对PharmaDB药效团库中6000余种靶点药效团逐一进行匹配计算,对Zey进行作用靶点分析。应用Western blot技术研究①Zey对内源凋亡通路和外源凋亡通路标志性蛋白表达的影响；②Zey对Bcl-2家族蛋白表达的影响；③Zey对Caspase家族凋亡标志性蛋白表达的影响；④Zey对ERK/MAPK通路激酶磷酸化水平的影响；⑤Zey对PI3K/AKT/mTOR通路激酶磷酸化水平的影响；⑥应用小分子抑制剂确定Zey作用PI3K/AKT/mTOR信号通路及其上游RTKs的关键靶点蛋白。5.Zey体内对人宫颈癌HeLa裸鼠移植瘤药效实验及分子机制研究采用人宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植成瘤,再把裸鼠传代2代以上的瘤块,使用套管针接种于裸鼠腋部皮下,建立人宫颈癌裸鼠异体移植瘤模型。分别以7.5mg/kg,

SCH727965体内 15mg/kg剂量腹腔注射给药,连续14天,观察Zey对人宫颈癌移植瘤模型动物的体重、瘤体积和瘤重的影响,计算抑瘤率和T/C值；采用免疫组化和Western blot检测Zey对肿瘤组织中相关信号通路蛋白表达的影响。结果：1.Zey体外抗肿瘤作用的初步研究体外抗肿瘤实验表明,Zey对10种不同来源的恶性肿瘤细胞均具有明显的抑制活性,其IC50值范围为3.3-25.7μM,其中宫颈癌HeLa和Caski细胞对Zey较为敏感,IC50值分别为4.2和3.3μM,而对2种正常细胞WPMY1和SV-HUC-1的抑制作用显著低于肿瘤细胞,IC50值分别为81.4和98.4μM,表明其对肿瘤细胞具有很好的选择性。时效、量效实验表明Zey对HeLa和Caski细胞的抑制作用具有很好的时间-剂量依赖性。Zey干预24

h后,HeLa和Caski细胞皱缩,透光度增加,贴壁能力下降；DAPI染色可以观察到染色质固缩、细胞核碎裂、核解体等现象；克隆实验显示Zey对HeLa和Caski细胞具有较强的集落形成抑制能力；流式细胞仪检测Zey能够将HeLa和Caski细胞分别阻滞在G0/G1期和S期；明胶酶谱实验检测Zey能够抑制HeLa细胞的基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的分泌。2. NVP-TAE684溶解度 SILAC分析Zey对肿瘤细胞蛋白质组表达变化的影响为了明确Zey抗肿瘤作用的蛋白质组变化,从而能够高效、快速地定位Zey可能的作用靶点和作用机制,应用SILAC蛋白组学技术对Zey作用前后的蛋白质组的变化进行了筛选。结果发现Zey作用HeLa细胞24 h导致229个蛋白显著改变,15个蛋白表达上调,214个蛋白表达下调,其中下调幅度较大的蛋白包括：14-3-3protein theta、14-3-3 protein zeta/delta、Bcl-2、Mcl-1、Bcl-xL、PARP1、HSP70 1A/1B、 HSP 90-beta、HSP70-4、HSP beta-1、HSP105、HSP 90-alpha、RPL38、RPL17、RPS8、 RPL7a和RPL37a等,这些蛋白主要与细胞能量代谢、细胞凋亡和细胞周期相关。3.Zey诱导肿瘤细胞凋亡作用研究在SILAC实验结果的基础上,我们进一步考察Zey是否能够诱导细胞凋亡。通过透射电镜观察、AO/EB染色、TUNEL、JC-1检测线粒体膜电位、Annexin V-FITC双染检测细胞凋亡的时期和比例以及DCFH-DA荧光探针检测活性氧等实验,可观察到Zey干预24 h后,HeLa和Caski细胞表现出明显的凋亡形态,在超微结构下,能够观察到凋亡小体的产生,线粒体膜电位显著降低,产生大量活性氧,HeLa和Caski细胞凋亡比例最高可分别达到：83.68%和88.00%,表明Zey可明显诱导HeLa和Caski细胞的凋亡。4.Zey体外抗肿瘤分子机制研究对Zey抗肿瘤分子机制的研究发现其明显诱导肿瘤细胞凋亡,对凋亡的内源性通路和外源性通路均产生影响,可活化凋亡因子caspase-8, caspase-9, caspase-7, caspase-3以及PARP和Bid,而使FasL、Bcl-2、Bcl-xL等表达下降,FasL、Fas、FADD等表达上调,诱导线粒体内Cytochrome c和AIF释放到胞质。应用Discovery Studio 3.

Iso和Ami分别作用于CIA大鼠FLS,检测FLS中Ras, Raf, p-MEK1/2和p-ERK1/2表达变化, rIL-1α和U0126分别作用于CIA大鼠FLS,检测FLS中Gi表达、cAMP水平和蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)活性,探讨两信号转导的交叉对话及关键作用交叉位点。

2.根据FLS中Ras, Raf, p-MEK1/2, p-ERK1/2, Gi, cAMP水平和PKA活性的变化,观察CIA大鼠FLS在Ami, rIL-1或U0126分别作用下,Pae对Ras-MAPKs和G蛋白- AC–cAMP两信号转导交叉对话的影响及通过哪些环节发挥调节作用。 方法 用鸡Ⅱ型胶原(typeⅡcollagen, CⅡ)免疫Sprague-Dawley(SD)大鼠诱导CIA。在炎症出现后,灌胃给予CIA大鼠Pae(25, 50, 100 mg·kg-1),每天一次。大鼠体重每隔4天称重一次。用MK-550容积仪每隔4天测量大鼠右后足爪容积。采用0-4分尺度每隔4天评定关节炎指数(arthritis index, AI)。进行大鼠膝关节组织病理分析。分离和培养FLS。FLS被不同的激动剂、抑制剂或药物作用如Iso, JNJ-26481585临床试验 Ami, rIL-1, U0126或Pae。采用3H-TdR掺入法检测IL-1的活性。TNF-α和PGE2的产生分别采用125I放免试剂盒测定。运用免疫组化和Western blotting技术检测滑膜细胞中Gi, Ras, Raf, p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达。用竞争蛋白结合分析法(competitive protein

binding assay, CPBA)检测滑膜细胞中cAMP水平,用激酶发光分析法测定滑膜细胞中PKA的活性。 结果 Ⅰ.CIA大鼠FLS中Ras-MAPKs与G蛋白- AC–cAMP信号转导的交叉对话及关键作用交叉位点 1.大鼠CIA建立与评价。在CIA大鼠中可见明显的炎症反应,体重增长缓慢,足爪肿胀,关节炎指数升高,伴有关节滑膜组织增生、血管翳形成和软骨侵蚀。IL-1活性增强,TNF-α和PGE2的产生增加。 http://www.selleckchem.cn/products/streptozotocin.html 2. CIA大鼠FLS中Gi, Ras, Raf, p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达。CIA大鼠FLS中Gi, Ras, Raf, p-MEK1/2和p-ERK1/2表达增加。Gi, Ras, Raf和p-ERK1/2的表达在d20至d28较高,在d20前后p-MEK1/2的表达较高。 3. Ras-MAPKs信号转导对G蛋白-AC-cAMP信号转导的影响。rIL-1α可促进Ras, Raf, p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达,提高Gi蛋白表达、cAMP水平和PKA活性。U0126可抑制rIL-1α诱导的p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达,降低rIL-1α诱导的Gi蛋白表达、cAMP水平和PKA活性。rIL-1α作用15min后,Ras和Raf表达水平开始升高,作用30 min后,Gi表达水平开始升高。U0126作用30 min后,p-MEK1/2表达下降,作用60 min后,cAMP水平和PKA活性开始下降。 这些结果提示Ras-MAPKs路径的活化可以促进G蛋白偶联信号转导;抑制MAPKs级联应答能抑制G蛋白偶联信号转导。 4. G蛋白-AC-cAMP信号转导对Ras-MAPKs信号转导的影响及作用交叉位点。Iso可促进Gi蛋白表达,升高cAMP水平和PKA活性,但对Ras,

Raf, p-MEK1/2和p-ERK1/2无明显影响。Ami能抑制Ras, Raf, p-MEK1/2和p-ERK1/2表达,升高cAMP水平和PKA活性,对Gi蛋白表达无影响。Ami作用15 min时,开始提高cAMP水平和PKA活性;作用30 min时,Ras表达开始下降。这些结果提示升高cAMP水平和PKA活性能够抑制Ras–MAPKs级联应答;其作用交叉位点可能是通过PKA下调膜蛋白Ras表达,而进一步抑制Ras-MAPKs信号转导。 Necrostatin-1购买 Ⅱ. Pae对CIA大鼠FLS中G蛋白- AC–cAMP信号转导和Ras-MAPKs信号转导两信号转导路径联系的调节及作用环节 1. Pae抑制CIA大鼠炎症反应及FLS中炎症介质的产生。Pae恢复CIA大鼠降低的体重,抑制足爪肿胀,减低AI,改善组织病理。Pae也明显抑制FLS中IL-1的活性及TNF-α和PGE2的产生。 2. Pae对CIA大鼠FLS中G蛋白- AC–cAMP信号转导的调节作用。CIA大鼠FLS中Gi蛋白表达增加,cAMP水平和PKA活性下降。Pae体内和体外可以抑制Gi蛋白的表达,恢复低下的cAMP水平和PKA活性。 3. Pae对CIA大鼠FLS中Ras-MAPKs信号转导的调节作用。CIA大鼠FLS中Ras, Raf, p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达增加。体内和体外给予Pae后,Ras, Raf, p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达明显下降。 4.